鼠双微粒体-2基因沉默对人肝癌HepG2细胞移植瘤的抑制作用

随着生物学的发展,人们认识到肝癌相关的癌基因的激活及抑癌基因的失活与突变是导致肝细胞癌变的主要原因。p53有抑制细胞生长或诱导细胞凋亡的能力,鼠双微粒体-2基因是近年发现的一种癌基因,可以介导降解和抑制p53转录活性,起到负调节p53的抑癌作用,从而诱发肿瘤的发生。目前已有的研究结果表明,在消化系统肿瘤如肝癌、胃癌、食管癌中,MDM2都是过表达的。小分子干扰RNA技术已经成为筛选药物靶点的公认方法之一,可以用RNA干扰技术抑制原癌基因及突变的抑癌基因等的表达来抑制肝癌的发生和发展。本研究构建Silencer-siRNA-MDM2(siMDM2)表达载体,探讨其在裸鼠体内对MDM2基因的特异性沉默及其对瘤体增殖的抑制作用。
　　材料与方法
　　1.细胞、实验动物和试剂:胎牛血清和IMDM培养基购自美国Gibco公司,Teagent，逆转录和PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司,试剂盒购自美国Ambion公司,Lipofectamine2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司;引物由上海生工生物技术公司合成。兔抗人MDM2,w-p53、β-肌动蛋白(β-actin)抗体及羊抗兔第二抗体购自美国Upstat公司。人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院上海细胞研究所。实验用裸鼠,雌雄各半,4~6周龄,体质量20~26g,购自北京中国医学科学院实验动物研究所,并在无菌、恒温(25~37℃)、恒湿(湿度45%~50%)的无特定病原体层流罩中饲养,所有饲料、饮用水及垫料经高压灭菌处理,每3d更换饲料、饮用水及垫料。
　　2.siRNA的设计、合成和鉴定:根据已知GenBankMDM2mRNA序列和siRNA的设计原则,利用美国Ambion公司的在线设计来寻找靶序列,并做同源序列搜索,排除与其他编码序列或EST同源的序列。siMDM2-1序列为:5′-AAGAAGAGAGTGTGGAATCTA-TTCAAGAGA-TAGATTCCACACTCTCTTCTT-3′;siMDM2-2序列为,:5'-CCACCTCACAGATTCCAGC-TTCAAGAGA-GCTGGAATCTGTGAGGTGG-3′。用SilencersiRNAconstruction试剂盒体外合成siMDM2-1和siMDM2-2,阴性对照controlsiRNA购自美国Ambion公司,与任何编码序列无同源性。紫外分光仪测量RNA在260nm处的吸光度(A)值,计算其浓度。取10ul重组质粒用HindⅢ+BamHI限制性内切核酸酶酶切鉴定,双酶切后电泳验证siMDM2真核表达载体构建正确。送上海生工生物工程公司检测核苷酸序列,测序结果与所设计的编码相应短发夹状siMDM2的寡核苷t,逆酸链的序列一致,证明质粒构建成功,阳性克隆命名为pgcSilencer-MDM2-siRNA。
　　3.裸鼠实验检测曲siMDM2对HepG2细胞在体内生长的影响:(1)裸鼠动物模型的建立:收集对数生长期的HepG2细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次,锥虫蓝染色后计数,活细胞在呖%以上。取2×10的6次方个HepG2细胞(0.2ml)接种于裸鼠背部皮下组织内。动物继续饲养于层流罩内,成瘤后随机分为4组,即注射盐水对照组、阴性对照质粒组,siMDM2-1组和siMDM2-2泛组,每组动物5只。肿瘤局部分别注射等渗盐水0.2ml,阴性对照质粒和曲DⅣ⒓重组质粒注射剂量为20ug/只。注射局部进行电转染以提高质粒在瘤体内的转染效率。(2)观察项目:每天观察裸鼠各种生活变化和肿瘤生长情况,每隔3d用游标卡尺测量瘤体大小和称量裸鼠体质量,测量肿瘤的长径(L)和短径(W),根据公式V=L×W2×0.52犯来计算肿瘤的体积,并绘制肿瘤的生长曲线。1个月后脱颈法处死裸鼠,解剖取肿瘤组织,称重,做病理切片检查并计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率(%)=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。
　　4.半定量RT-PCR检测基因的表达:分别提取各组肿瘤组织总RNA,电泳鉴定其质量。cDNA第一链合成试剂盒逆转录总RNA,PCR扩增目的基因,操作均严格按试剂盒说明书进行。以β-actin作为内参照,MDM2扩增产物300bp,上、下游引物序列分别为5'-AACCACCTCACAGATrCcAG-3′和5'-TCAAGGTGACACCTGTTCTC名′;p53扩增引物独0bp,上、下游引物序列分别为5′GTGGTGGTGCCCTATGAG-3′历阳5′-GGGAGGTAGACTGACCCTATGA-3′;β-action扩增产物520bp,上、下游引物序列分别为5'-GGACCTGACAGACTACCT-3′和5′-CGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。PCR产物经1%琼脂糖凝胶系统电泳(含溴化乙啶),拍照鉴定。用PharmaciaImageMaster凝胶成像仪观察,并用ImageMaster软件分析条带峰面积。
　　5.Westemblot检测蛋白质表达:分别取各组肿瘤标本,加人预冷的蛋白裂解液,超声裂解后离心取上清液,用Bradford法测定总蛋白含量。取80ug蛋白样品按体积比4∶1加人上样缓液,100℃变性3min,10%十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳分离后,电转移至硝酸纤维素膜,经脱脂奶粉封闭液封闭,将硝酸纤维素膜依次与兔抗人MDM2、w-p53、β-actin第一抗体(体积比1∶1000稀释)及羊抗兔第二抗体(体积比1:2000稀释)共孵育,二氨基联苯胺(DAB)显色,凝胶成像系统上扫描分析。检测用Labworks扫描分析软件系统检测MDM2、w-pS3和β-actin的积分A值。
　　6.统计学方法:用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,计量资料数据用均数±标准差表示,经正态检验后,各组数据均成正态分布。组间比较采用单因素方差分析以及LSD检验,率的比较用检验,P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果
　　1.肿瘤生长情况和生长曲线:HepG2细胞在裸鼠皮下移植接种率高,各组在1周左右均有肿瘤生长。siMDM2-1组和siMDM2-2组,空白对照和阴性对照组肿瘤的生长趋势一致,差异均无统计学意义（t值分别为0.978和1.956,P值均>0.05)。转染siMDM2-1组和siMDM2-2组肿瘤体积均明显小于对照组,差异均有统计学意义（t值分别为9.780和8.802,P值均<0.05)。以上结果说明转染siMDM2可显著抑制人肝癌HepG2细胞在裸鼠体内的生长。
　　2.肿瘤抑制率:处死裸鼠,检测各组在裸鼠体内的瘤质量及抑瘤率,空白对照组,阴性对照组,siMDM2-1组和siMDM2-2组裸鼠形成瘤质量分别为(3.3±0.56)g、(2.9±0.31)g、(1.3±0.06)g、(1.5±0.07)g。对照组肿瘤质量明显大于转染咖siMDM2-2组,差异有统计学意义（t值分别为7.823和6.845,P值均<0.01),转染siMDM2-1组和siMDM2-2组之间差异无统计学意义（P>0.35)。转染siMDM2-1组和siMDM2-2组裸鼠抑瘤率分别为60.6%和54.6%。
　　3.RT-PCR检测结果:转染后各组β-actinmRNA表达量基本相同,阴性对照组和空白组p53和MDM2的基因表达量相似(P值均>0.05),转染觎Ⅲ/D1和m旺涮⒐2组的ps3和MDM的基因表达量相似P值均)0.6)。与对照组比较,转染siMDM2-1组和siMDM2-2组的p53和MDM2的基因(300bp)表达量有不同程度的下调,p53基因(490bp)表达水平有不同程度上调。与空白组比较,转染siMDM2-1组和siMDM2-2组的MDM2mRNA的表达量分别下调62.8%和61.6%。p53mRNA表达量分别上调。47.1%和45.6%(F=17.676,P<0.01)差异均有统计。
　　4∶Westernbiot检测结果:转染后各组β-actin蛋白质表达量基本相同,阴性对照组和空白组的p53和MDM2蛋白质表达量相似(P值均>0.05),转染siMDM2-1组和siMDM2-2组的pS3和MDM2蛋白质表达量相似(P值均>0.05)。与空白组比较,转染siMDM2-1组和siMDM2-2组的MDM2蛋白表达量分别下调60.7%和59.5%(F=47.860,P<0.01),p53蛋白表达量分别上调45.9%和44.3%(F=235.770,P<0.01),差异均有统计学意义。
　　讨论
　　肝癌的发生涉及多种致病原因和危险因素,人们认识到肝癌相关的癌基因的激活及抑癌基因的失活与突变是导致肝细胞癌变的根本原因。与此同时,一个全新的基因治疗概念,为肿瘤的治疗带来了新的希望。肿瘤的基因治疗最终目的是通过不同途径杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤生长使肿瘤消退。利用RNA干扰和反义技术阻止癌基因的过度表达并使其逆转是肿瘤的基因治疗主要的方法之一。siRNA可以特异性地降解相应基因的mRNA,从而抑制该基因的表达,siRNA每一条链均有2个核苷酸3′突出端,介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子,其作用类似于基因敲除,但较其技术简单、快捷。siRNA技术与其他单克隆抗体和反义核苷酸方法相比,具有更高的效率和特异性,为肿瘤基因治疗提供了一个有效的的方法。
　　近年来,许多研究结果显示,MDM2参与了许多肿瘤的发生和发展,并且该基因与恶性肿瘤的浸润、转移和不良预后有关,尤其与食管癌、胃癌、结肠癌和肝癌等消化系统肿瘤的关系密切。所以,研究MDM2与消化系统肿瘤的关系在肿瘤防治中具有重要意义。最近,美国普林斯顿科学家的研究报道也显示,p53基因受到MDM2基因的严格控制。高度表达的MDM2可与p53形成复合物来封闭p53介导的反式激活作用,使p53降解,导致p53功能丧失。MDM2基因编码的p53蛋白能与p53基因结合,使p53失去正常的功能。MDM2蛋白还可通过本身结构结合p53并将之从核内转移到胞质使其降解。MDM2蛋白氨基端的氨基酸残基结合到p53蛋白反式激活功能区,使p53转录激活区不能与关键的转录相关蛋白结合而丧失转录激活活性;另外,MDM2通过转录因子复合物,直接抑制p53反应性启动子激活的转录过程。总之,无论是抑制了p53基因的反式激活功能,还是直接抑制p53反应性启动子激活的转录过程,都可以促使基因的不稳定及细胞增生,表现出癌基因蛋白的作用,导致肿瘤形成。
　　本实验采用裸鼠建立肝癌动物模型,研究在裸鼠体内siMDM2转染对人肝癌HepG2细胞肿瘤生长的影响。本实验结果显示裸鼠肝癌模型建立成功,对照组和阴性质粒组肿瘤呈浸润性生长,而siMDM2组肿瘤生长明显受抑制,并且MDM2表达量明显下降,提示在裸鼠体内转染siMDM2载体可以抑制MDM2基因的表达从而抑制肿瘤的生长。siMDM2可以抑制肿瘤细胞增殖,使肿瘤生长速度明显降低,且通过siRNA的方法可使裸鼠体内种植瘤的MDM2基因沉默,可以进一步肯定MDM2基因与肝癌细胞的增殖和侵袭密切相关,其高表达利于肝癌细胞增殖,在肝癌的发生和发展中发挥重要作用,而抑制肝癌细胞MDM2基因表达就可抑制肝癌细胞增殖,限制肿瘤发展及转移,阻碍肿瘤恶性程度进一步增高。
　　本实验发现siMDM2组肿瘤细胞促凋亡基因p53比阴性对照组和空白对照组表达增多。P53可以促进肿瘤细胞凋亡可达到抑制肿瘤生长的作用,提示siMDM2抑制MDM2基因表达的同时亦增强了p53的表达而促进肿瘤细胞凋亡,从而起到抑制肿瘤的作用,这和国内外其他研究组的研究结果一致。本实验在裸鼠体内应用能高效特异阻断MDM2基因表达的siRNA技术,使肝癌肿瘤增殖受到抑制,为进一步验证MDM2在肝癌中的作用及探讨其机制,开发有效的肝癌基因治疗靶点提供了实验数据。NIDM2可能成为消化系统肿瘤防治研究的一个新靶点,但是目前的研究尚在实验室阶段,因此,需要对NIDM2基因做进一步研究,并对其在肿瘤发生和发展中的作用深入认识,这可能为恶性肿瘤的预防和治疗开创新的思路和途径。
　　参考文献
　　1.Dongiovanni P,Fracanzani AL,Cairo G. Iron-dependent regulation of MDM2 influences p53 activity and hepatic carcinogenesis[J].American Journal of Pathology,2010.1006-1017.
　　2.Zhang MF,Zhang ZY,Fu J. Correlation between expression of p53,p21/WAF1,and MDM2 proteins and their prognostic significance in primary hepatocellular carcinoma[J].Journal of Traditional Medicines,2009.110.
　　3.Zdzalik M,Pustelny K,Kedracka-Krok S. Interaction of regulators Mdm2 and Mdmx with transcription factors p53,p63 and p73[J].Cell Cycle,2010.4584-4591.
　　4.Akkiz H,Sümbül AT,Bayram S. MDM2 promoter polymorphism is associated with increased susceptibility to hepatocellular carcinoma in Turkish population[J].Cancer Epidemiol,2010.448-452.
　　5.王金国,傅耀文,孙辉. 体内TIMP-3基因电转染治疗人前列腺癌裸鼠移植瘤的研究[J].中国老年医学杂志,2006.1073-1074.
　　6.陈冰琳,郭坤,刘银坤. 黏附分子CD44的表达及其糖基化与肝癌转移的相关性[J].中华肝脏病杂志,2011,(12):898-903.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2011.12.005.
　　7.孙海艳,李岩,郭坤. 肝癌转移相关的骨桥蛋白表达及其糖基化的改变[J].中华肝脏病杂志,2011,(12):904-907.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2011.12.006.
　　8.卢燕辉,徐成润,陈洁. RUNX3 mRNA在原发性肝癌组织中的表达分析[J].中华肝脏病杂志,2011,(12):940-941.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2011.12.016.
　　9.Hagymási K,Tulassay Z. New possibilities of targeted therapy in the treatment of hepatocellular carcinoma with the help of molecular biology[J].Orvosi Hetilap,2010.1763-1768.
　　10.梁明,李晶媛,黄海英. 小干扰RNA沉默垂体瘤转化基因1对肝癌细胞增殖和凋亡水平的影响[J].中华肝脏病杂志,2011,(9):703-705.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2011.09.018.
　　11.Xiong GS,Sun HL,Wu SM. Small interfering RNA against the apurinic or apyrimidinic endonuclease enhances the sensitivity of human pancreatic cancer cells to gemcitabine in vitro[J].J Dig Dis,2010.224-230.
　　12.李光明,李定国,范建高. 沉默结缔组织生长因子对大鼠肝纤维化的影响[J].中华肝脏病杂志,2010,(11):822-825.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2010.11.008.
　　13.Jung CR,Lim JH,Choi Y. Enigma negatively regulates p53 through MDM2 and promotes tumor cell survival in mice[J].Journal of Clinical Investigation,2010.4493-4506.
　　14.Miliani de Marval PL,Zhang Y. The RP-Mdm2-p53 pathway and tumorigenesis[J].Oncotarget,2011.234-238.
　　15.Berberich SJ. RNAi knockdown of HdmX or Hdm2 leads to new insights into p53 signaling[J].Cell Cycle,2010.3640-3641.