荧光定量分型PCR法在HBV-DNA检测中的应用

　　乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)可引起慢性、急性肝炎，甚至肝癌，对人体健康危害非常大[1]。根据HBV全基因组序列差异大于或等于8%，或者S基因序列大于或等于4%，临床上通常将HBV分为A～H型，共8个基因型[2]。我国主要分布的基因型有：B型、C型，以及B、C混合型。因此，对HBV感染进行正确分型，对于指导诊断和治疗有重要意义。HBV-DNA是HBV感染最直接，灵敏性最高的指标。本院以120份HBV-DNA阳性样本为研究对象，探讨荧光定量分型PCR在HBV-DNA检测中的作用。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料　收集2012年9月至2013年9月本院感染科住院部收治的乙肝患者作为研究对象。纳入标准：(1)符合2000年病毒性肝炎防治方案的诊断标准[1];(2)HBV表面抗原(HBsAg)均为阳性;(3)获得患者知情同意。排除标准：(1)孕产妇、哺乳期妇女;(2)合并有心、肝、肾功能障碍者;(3)合并有其他可能影响实验结果的疾病。符合纳入排除标准的共120例，其中男性69例，女性51例;年龄23～78岁，平均(47.6±12.8)岁;病程0.5～5年，平均(1.2±0.4)年。

　　1.2　仪器与试剂　仪器：CFX96TM实时定量PCR仪、凝胶成像仪为美国Bio-Rad公司产品。ABI3100GeneticAnalyzer为美国ABI公司产品。试剂：PCR试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供，试剂盒DNAMarker为日本TaKaRa公司产品。

　　1.3　方法　空腹采血，离心后用煮沸裂解法从血清中提取HBV-DNA，于-20℃的环境下保存待检。荧光定量分型PCR基因分型：PCR反应总体积大约为20μL，其中包括2μLDNA模板，10μL反映混合液，另外还有3种不同分型的探针和引物，包括2μL(0.3μmol/L)B型探针、2μL(0.3μmol/L)C型探针以及2μL(0.5μmol/L)B、C型引物。然后由CFX96TMPCR扩增仪进行扩增检测，并采用CFXManagerTM1.1软件进行数据分析[4]。直接测序基因分型：将S基因区域进行扩增，扩增的条件为94℃预变性5min，55℃30s，72℃30s。接着采用双脱氧链末端终止法对测序片段进行扩增纯化变性，并对序列进行分析，统计数据[3]。最后用NCBI工具进行基因分型，比如双峰则被认为是B、C型混合感染。TA克隆：对两种检测方法检测结果不一致时进行TA克隆，挑取大约20～40个阳性克隆之后，对单菌落测序检测其基因型。

　　1.4　统计学处理　采用SPSS17.0统计软件录入并进行统计学分析。一致性计算采用一致性计算公式，定性资料的描述采用χ 2检验和秩和检验。以p<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结　　果

　　2.1　两种方法的基因分型结果　共对120例样本进行检测，且均被荧光定量分型PCR法和直接测序法成功分型;两种方法检测结果显示基因中只存在3种类型的基因型，分别为B型、C型以及B、C型混合感染，B型在这些基因型中所占的比例最大。荧光定量分型PCR检出29例(24.17%)混合感染样本，直接测序法检出7(5.83%)例，荧光定量分型PCR法检出率高于直接检测法(χ 2=15.817，p=0.000)。见表1。

　　2.2　两种检测方法基因分型结果一致性检验　两种检测方法对120例样本成功分型，对两种方法的一致性进行检测，得Kappa值系数为81.67%，大于75%，说明一致性较好。见表2。

　　2.3　TA克隆基因分型结果　经过两种方法检测得到总共22份检测结果不一致的样本，从其中随机选出由荧光定量分型PCR法检测为混合感染，而直接测序法检测为单一型感染的10份样本进行TA克隆，分别挑选出50个克隆后测序检测基因型，结果发现10份样本均存在B型和C型基因，说明样本为混合感染，与荧光定量分型PCR法的检测结果相同。

　　3　讨　　论HBV是一种与DNA有关的病毒，它是引起人类急、慢性肝炎的DNA病毒，也被称为丹氏颗粒[5]。临床上通常将HBV根据其全基因组序列差异或者S基因序列分为8个基因分型[6]。这8个基因分型主要是由长期病毒突变以及宿主的筛选累积形成的，因此它不仅能反映出病毒种系发生关系以及核算变异程度，而且与感染者的临床表现、抗病毒疗效以及预后情况息息相关[7]。HBV-DNA是HBV感染最为直接、特异和敏感的指标，HBV-DNA阳性则表示HBV复制且有传染性[8]。HBV-DNA定量检查是检查HBV在人体血液中的含量，这对于指导医务工作者了解患者的病情发展状况，并采取更好的治疗方式有重要意义。研究显示我国分布的主要基因型是B型、C型，以及B、C型混合感染。对于基因型检测方法主要包括序列分析法、PCR分型法、聚合酶反应法、杂交法以及酶联免疫法[9]。以往临床上通常将序列分析法作为HBV基因分型的金标准，但该方法的操作过程复杂，且耗时、耗力[10-12]。荧光定量分型PCR法作为一种新兴的方法被用于临床，为了研究荧光定量分型PCR法在HBV-DNA阳性检测中的应用，本院展了本次研究。本次研究中作者选用的探针为TaqMan，该探针是一种寡核苷酸探针，其5′末端连有荧光基团，3′末端连有淬灭基团。探针配对靶序列时，荧光接近淬灭基团就会被淬灭;而延伸反应中，聚合酶5′端外切酶活性切断探针，致使荧光、淬灭两基团分离，荧光可发射。随着扩增循环数的不断增加，荧光基团的释放量也就得到了不断积累。本研究发现，两种方法检测结果显示基因中只存在3种类型的基因型，分别为B型、C型，以及B、C型混合感染，B型基因在这些基因型中所占的比例最大。荧光定量分型PCR检出了29例(24.17%)混合感染样本，直接测序法检出7例(5.83%)，荧光定量分型PCR法检出率高于直接检测法(χ 2=15.817，p=0.000)。两种方法进行一致性检测，得Kappa值为81.67%，大于75%，说明一致性较好。两种方法检测得到总共22份检测结果不一致的样本，从其中随机选出由荧光定量分型PCR法检测为混合感染，而直接测序法检测为单一型感染的10份样本进行TA克隆，分别挑选出50个克隆后测序检测基因型，结果发现10份样本均存在B型和C型基因，说明样本为混合感染，与荧光定量分型PCR法的检测结果相同。从本次研究结果中可以看出，荧光定量分型PCR法是一种以特异性探针法为主的检测方法，尤其对于混合感染的检测敏感度较高。而且该方法操作简便、特异度高，且降低了检测过程中的污染的可能性，使整个检测的速度得到提升。综上所述，荧光定量分型PCR法是一种简便、快速、高效的HBV基因分型法，对基因型混合感染样本的检出率高于直接测序法，且正确率高，适合针对我国分布的主要HBV基因型进行分型检测，值得在临床上推广应用。

　　参考文献

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　　[11]陈永琴，金文君，戴梦璐.慢性乙型肝炎患者IFN-γ、IL-10和CD19+水平检测与病毒载量的关系[J].检验医学，2013，28(4)：336-338.

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　　(收稿日期：2013-10-08)