乙酰肝素酶在肾癌中的表达及其生物学意义

乙酰肝素酶(heparanase，Hpa)作为哺乳动物体内唯一可以裂解硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparin sulfate protoglycan，HSPG)中HS链的内切糖苷酶，与胚胎发生、伤口愈合、组织修复、炎症以及肿瘤转移等过程密切相关[1]。已有研究表明，Hpa在食管癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌等多种肿瘤中都有高表达，且其表达水平与肿瘤的浸润转移及不良预后有关。Hpa与肾癌发生、发展及其预后等方面相关报道较少。本研究采用免疫组化的方法检测Hpa蛋白在肾癌及癌旁正常组织中的表达，分析其与临床病理特征的关系，初步探讨Hpa在肾癌发生及浸润转移过程中可能的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1标本来源：收集2008年1月～2010年1月间西安交通大学医学院第一附属医院手术切除并经病理确诊的肾癌标本54例。男37例，女17例;年龄35～82岁，平均54岁;根据2004年WHO肾细胞癌病理分类标准，透明细胞癌33例，颗粒细胞癌13例，其它类型肾细胞癌8例;根据1997年WHO推荐肾癌组织学分级，高分化癌12例，中分化癌26例，低分化癌16例;根据2002年AJCC肾癌临床分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期16例，Ⅲ期15例，Ⅳ期11例。所有肾癌病例手术前均未经放疗、化疗以及免疫治疗。正常肾脏组织标本20例取自远离肿瘤(距肿瘤>5 cm)的肾脏组织，经病理证实为正常肾脏组织。标本离体后迅速处理，以生理盐水冲洗两遍，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，备用。

1.2主要试剂与仪器：兔抗人Hpa多克隆抗体(武汉博士德公司)，PV6000免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉公司)，Motic Med6.0数码图像分析系统(厦门麦克奥迪公司)，石蜡切片机(德国Leica)。

1.3实验方法：采用免疫组织化学PV6000二步法。阳性对照片由试剂公司提供，PBS代替一抗作为阴性对照。Hpa抗体按照1：60滴度使用，用前新鲜配制。石蜡标本4μm厚连续切片3张，1张作HE染色，另外2张行Hpa免疫组化染色。组织切片二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，0.01 mmol/L的PBS冲洗5 min×2次，3%H2O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。微波修复抗原，PBS冲洗5 min×3次。滴加正常血清封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体。滴加配制好的一抗，37℃孵育60 min，蒸馏水洗去未结合的一抗，PBS冲洗2 min×3次。滴加通用型IgG抗体(Fab段)-HRP多聚体，37℃孵育30 min，PBS冲洗2 min×3次。滴加新鲜配制的DAB显色液，在显微镜下观察反应过程，入蒸馏水浸洗中止反应。分别入苏木素、盐酸酒精、氨水后用水冲洗干净。梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树脂封片。

1.4结果判断：Hpa蛋白免疫组化染色阳性信号主要定位于细胞质内，其表达以胞质呈清晰棕黄色或棕褐色为阳性，细胞质内无棕黄色或与背景着色一致为阴性。显微镜下观察并计数阳性细胞的比例，根据所占比例分为：(-)：阳性细胞数小于10%;(+)：阳性细胞数大于10%。免疫组化染色切片图像分析：采用Motic Med6.0数码医学图像分析系统对免疫组化染色结果进行图像分析。

由彩色摄像机提取图像后输入图像分析系统，准确分割阳性区域，测量该区域的灰度值作为免疫组化蛋白表达强弱的定量指标，灰度值的大小与蛋白表达强度成反比。

1.5统计学方法：采用SPSS11.0软件包对数据进行统计分析。率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验或方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1　Hpa在肾癌及正常肾脏组织中的表达：Hpa蛋白表达主要位于细胞浆，阳性反应产物为黄色或棕黄色颗粒，以不均匀局灶性分布为主。20例正常肾脏组织中Hpa阳性表达2例，阳性表达率为10%(2/20)。54例肾癌组织中Hpa阳性表达35例，阳性表达率为64.81%(35/54)，显著高于正常肾脏组织，差别有统计学意义(P=0.000)。

2.2　Hpa在肾癌中的表达与临床病理特征之间的关系：免疫组化结果分别采用阳性率和灰度值进行统计学分析，灰度值大则表示阳性表达弱。Hpa的表达与肾癌患者肿瘤的大小、临床分期、是否转移相关(P<0.05)，与性别、年龄、病理类型、组织学分级无明显相关性(P>0.05)，见表1。

3  讨论

肿瘤的浸润、转移必须具备两个条件：①肿瘤细胞侵犯细胞外基质和基底膜组成的屏障;②肿瘤新生血管形成。硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparin sulfate protoglycan，HSPG)是ECM与BM的主要成分，它由一个蛋白核心和数个与之共价连接的线性硫酸乙酰肝素侧链组成，其降解是肿瘤细胞侵袭转移的重要环节。而Hpa作为哺乳动物体内唯一可以裂解HSPG中HS链的内切糖苷酶，在肿瘤细胞穿越ECM和BM，实现侵袭、转移过程中的作用受到广泛关注。Hpa基因定位于人类染色体4q22并与遗传标记D4S400相连，编码一种分子量约为61.2 kD，由543个氨基酸残基组成的多肽链[2]。现有的研究表明[3]，Hpa促进肿瘤浸润转移的机制可能包括：①通过降解HSPG，破坏ECM及BM稳定结构，降低其屏障功能，加速肿瘤细胞浸润和转移;②Hpa可将HSPG结合的具有高度活性的bFGF、VEGF等生长因子从微环境中释放出来，刺激肿瘤血管生成;③通过促进释放尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及组织纤溶酶原激活物(tPA)，溶解基质网状结构，活化金属基质蛋白酶(MMPs)，促进HS结合的活性bFGF的释放，以发挥其促细胞转移的作用;⑤抑制T淋巴细胞活性，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。

Nobuhisa等[4]应用RT-PCR方法对54例结肠癌患者进行研究，发现Hpa mRNA在癌组织的阳性表达率为69%，高于正常组织并与肿瘤的微血管密度、淋巴管侵袭、TNM分期、及生存期有关。Wang等[5]对胃癌进行研究也发现Hpa的表达与胃癌的分期、肿瘤浸润深度及淋巴结转移有关。尽管已知Hpa在多种恶性肿瘤中高表达，其表达水平与肿瘤的恶性程度正相关，与患者的预后负相关，但是关于Hpa表达与肾癌关系的研究相关报道较少。本研究结果显示，Hpa在肾癌组织中的表达水平显著高于正常肾脏组织，差别有统计学意义(P<0.05)，提示Hpa可能与肾癌的发生有关。在不同的性别、年龄、病理类型和组织学分级肿瘤中，Hpa的表达差异无统计学意义(P>0.05)。随着肿瘤体积的增大，Hpa的表达亦呈上升趋势(P<0.05)。随着临床分期的增加，Hpa的表达亦呈上升趋势，在Ⅳ期肾癌中的表达率达到100%，提示Hpa可能在肾癌的浸润转移中具有重要作用，Hpa高表达的肾癌具有更高的恶性潜能，对Hpa的检测可以间接判断肿瘤的生物学行为。采用计算机图像分析技术对Hpa在肾癌中表达的强度进行定量分析后，得出了与人工计数阳性细胞一致的结论。

Edovitsky等[6]通过转染表达siRNAs的质粒载体到能高表达内源性Hpa的人乳腺癌MDA-MB-435细胞中后发现，携带有抗Hpa siRNAs的细胞系中Hpa的表达明显降低，在体外能明显减少肿瘤细胞的侵袭和黏附，在实验动物体内能明显减少肿瘤血管形成和转移灶数目，动物存活时间延长。国内涂响安等[7]通过PCR方法检测肾癌和癌旁正常组织中HpamRNA的表达水平，结果提示其表达率与肿瘤的病理分级、临床分期和淋巴结转移有相关性(P<0.05)。本研究结果与国内有关Hpa和肾癌关系的研究一致，进一步证实了Hpa可能在肾癌的发生、发展以及浸润转移中发挥重要作用，并有可能成为肾癌靶向治疗的新靶点。

4　参 考 文 献[1] Vlodavsky I， Friedmann Y， Elkin M， et al. Mammalianheparanase： gene cloning， expression and function in tumor progression and metastasis[ J] . Nat Med， 2001， 5 ( 7) ： 793.

[2]Dong J， Kukula AK， Toyoshima M， et al. Genomic organization and chromosome localization of the newly identified humanheparanase gene[ J] . Gene， 2000， 253(2)：171.

[3] Gohji K， Katsuoka Y， Okamoto M， et al. Human heparanase： roles in invasion and metastasis of cancer[ J] . HinyokikaKiyo， 2000， 46 ( 10) ： 757.

[4] 　Nobuhisa T， Naomoto Y， Ohkawa T， et al. Heparanase expression correlates with malignant potential in human colon cancer[ J] . J Cancer Res Clin Oncol， 2005，131(4)：229.

[5] 　Wang Z， Xu H， Jiang L， et al. Positive association of heparanase expression with tumor invasion and lymphatic metastasis ingastric carcinoma[ J] . Mod Pathol， 2005， 18 ( 2) ： 205.

[6] 　Edovitsky E， Elkin M， Zcharia E， et al. Heparanase gene silencing， tumor invasiveness， angiogenesis， and metastasis [ J] . JNatl Cancer Inst， 2004， 96 ( 16) ： 1219.

[7] 　涂 响 安 ， 丘 少 鹏 ， 邓 春 华 ， 等 . 乙 酰 肝 素 酶 基 因 和 蛋 白 表达 的 研 究 [ J] . 现 代 泌 尿 外 科 杂 志 ， 2007， 12( 5) ： 287.