GnRH类似物对体外肝癌细胞Hsp90表达的影响及其意义

近年研究发现肝癌细胞为GnRH自分泌细胞，GnRH能够促进肝癌细胞的凋亡，热休克蛋白90（Heat shock protein90， HSP90）作用于细胞的抗凋亡机制，在肝癌的发生发展中起着重要作用。本研究拟用不同浓度GnRH类似物阿拉瑞林刺激HepG2 肝癌细胞，观察其增殖阻抑作用并观察Hsp90的变化，为应用 GnRH类似物及Hsp90拮抗剂治疗原发性肝癌提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料：人肝癌细胞系HepG2购于西安第四军医大学细胞中心。Hsp90单克隆抗体及SP试剂盒购自武汉博士德生物公司； GnRH类似物阿拉瑞林购自重庆川康派德公司；MTT试剂盒购自晶美生物制品公司。

1.2 方法

1.2.1 噻唑蓝（MTT）比色：①细胞培养：HepG2肝癌细胞系常规培养，制备浓度为2×104个/ml单细胞悬液，以每孔200 μl接种于96孔培养板中。取10-3 mol/L、10-4 mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/ L、10-7 mol/L 5个浓度组阿拉瑞林培养24 h。②呈色：每孔加入 MTT溶液（5 mg/ml）20 μl孵育4 h终止培养，取上清液。每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min充分溶解。③比色：选择490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔OD值，记录结果。抑制率 =1－加药组OD值/对照组OD值计算抑制率及IC50（半抑制率）时的阿拉瑞林浓度。

1.2.2 免疫组织化学染色及图像分析：以IC50时的含阿拉瑞林培养液，于六孔板中分别培养HepG2肝癌细胞24 h、48 h，同时常规培养HepG2肝癌细胞做对照。将长有HepG2肝癌细胞的盖玻片从六孔板中取出，无水乙醇固定5 min，玻片分别经0.3%甲醇双氧水和1 g/L PBS处理30 min后，滴加正常羊血清孵育30 min；滴加Hsp90单克隆抗体（释度均为1:100）后4℃湿盒内孵育过夜； PBS冲洗后滴加l:100稀释的SP试剂盒室温下孵育1 h；最后滴加 DAB显色，镜下观察控制反应强度。PBS代替第一抗体进行孵育作阴性对照。应用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统测定其积分光密度（Integral optic density，IOD）值。在光学显微镜下随机选取5个视野进行测定，所得IOD值的平均值为最终值。

1.3 统计学分析：使用SPSS 10.0对各项资料进行统计、分析，各项参数以均数±标准差（ s x ± ）表示，采用t和χ2检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT比色结果：

2.2 积分光密度（IOD）测定结果：对照组（1组）10例，IOD 值（2 036.10±95.43）；Alarelin（24 h，2组）10例，IOD值（1 756.87±65.56）；Alarelin（48 h，3组）10例，IOD值（1 248.08±97.35）

2.3 统计学分析结果：见表2。认为各组间差异有统计学意义（P＜0.05），Alarelin处理后HepG2肝癌细胞hsp90表达减少。

3 讨论实验研究和临床观察均证实肝癌细胞上存在GnRH结合位点，GnRH类似物在体外可通过增加细胞的凋亡抑制肝癌的生长。Pati等亦证实在人肝癌细胞系HepG2中有GnRH受体存在，并且GnRH类似物能够抑制HepG2细胞增殖[1]。在细胞凋亡的过程中，经线粒体通路介导的凋亡信号其重要的特征是凋亡体的形成。研究表明HSP90通过阻断Apaf-1寡聚化，最终阻断凋亡体的形成[2]。HSP90对凋亡体的调节是通过其分子伴侣功能来实现，提示对HSP功能的调节将直接影响其对凋亡体的调控作用。HSP90对死亡受体通路介导细胞凋亡的调控作用是通过维持RIP的稳定性，提高NF-B的活性，从而介入阻断TNF诱导的细胞凋亡，HSP90还通过调节AKT激酶而间接影响NF-B的活性。死亡受体介导的凋亡信号还可以通过由促凋亡蛋白Bid介导线粒体凋亡通路的活化，当Bid蛋白被剪切活化后可以由胞浆转移到线粒体，启动线粒体凋亡通路。新近的实验揭示Bid蛋白也属于 HSP90的底物蛋白，过表达HSP90可以保护Bid免于被切割和活化，从而阻断TNF诱导的细胞凋亡[3]。肝癌组织中Hsp90的表达与肿瘤的分化程度以及肿瘤大小密切相关[4]。肝癌的内分泌治疗作为一种高效低毒的治疗方法，日益引起广大学者重视。GnRH类似物及Hsp90抑制剂均是近几年肿瘤治疗领域研究的热点之一，两者均能同时产生多路径抗肿瘤效应。笔者在研究中发现，Hsp90在GnRH促进HepG2肝癌细胞凋亡的过程中表达减少并与时间呈正相关，GnRH可能通过降调Hsp90 发挥其对HepG2肝癌细胞的增殖阻抑作用，从而为临床联合应用 GnRH类似物及Hsp90拮抗剂治疗原发性肝癌提供参考。

4 参考文献

[1] Teplan I.Development and investigation of some peptides with antitumor activity[J].Acta Biol Hung,2000,51(1):1.

[2] Pandey P,Saleh A,Nakazawa A,et al.Negative regulation of cytochrome C-mediated oligomerization of Apaf-1 and activation of procaspase-9 by heat shock protein 90[J].EMBO J,2000,19(16):4310.

[3] Zhao C,Wang E.Heat shock protein 90 suppresses tumor necrosis factor alpha induced apoptosis by preventing the cleavage of Bid in NIH3T3 fibroblasts[J].Cell Signal,2004,16(2):313.

[4] 吴胜利,潘承恩,牛新捷,等.原发性肝癌中hsp90的表达及意义[J]. 中华肝胆外科杂志,2003,9(2):88.

[收稿日期：2013-10-17 编校：郑英善]