转Notch1基因T淋巴细胞白血病双荧光示踪斑的建立及鉴定

急性 T淋巴细胞白血病(Tacute lymphoid leukemia,T-ALL)是一类恶性淋巴细胞增殖性疾病 ,其特征为 T细胞恶性克隆积聚同时可伴肝脾等组织浸润。超过 60%的 T-ALL患者体内存在 Notch1基因突变，导致Notch信号通路过度激活[ 1]。 Notch受体是细胞表面蛋白家族 中的一员，它的信号转导失调会导致人类 多种疾病和肿瘤的发生[2- 3]。在人类 T-AI L亚型中鉴定出 t(7;9)(q34;q34.3)染色体的易位[4],这个染色体易位使 Nokh1胞内区域与 T细胞受体 -β链的启动子/增强区域在膜内侧面相邻，从而激活了T细胞中的Notch信号 [5]。研究 [6]发现 ,将截短的人 Notch1胞内功能域 (ICN1,Nlltch氨基酸序列 :17ω -2555)导人小鼠的造血前体细胞中过表达可导致 T-ALL的发生[6]。2007年 ,Che11等 [7]应用 T 淋巴细胞特异的 Rag2启动子驱动人ICN1(携绿色荧光),将其注射人斑马鱼胚胎中建立了斑马鱼T-ALL 模型。同期研究 [8- 9]还显示 ,Notch信号通路也是肿瘤新生血管主要的调控因素之一。而Notch1信号参与 T-ALL发生和肿瘤血管新生的关系仍不清楚。本研究在血管内皮增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的斑马鱼系 (fli1-EGFP)中 ,应用T淋巴细胞特异性 Rag2启动子驱动携带红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人源性 ICN1(ICN1-RFP),建立红绿双荧光示踪的双转基因 (Rag2-ICN1-RFP/fil1- EGFP)斑马鱼 T-ALL。 模型 ,为深入研究 Notch1促使T-ALL发生 、发展的分子机制以及探究 Notch1在 TALL发病过程中相应血管形成的变化提供研究平台。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用鱼野生型 AB品系斑马鱼 (WT)和fli1-EGFP标记的转基因品系斑马鱼(下文中简称fli1-EGFP斑马鱼 )由上海南方模式生物研究中心斑马鱼实验室提供。饲养温度为28.5℃ ;光照与黑暗时 间为12h:12h。野生型 AB品系和fli1-EGFP转基因品系斑马鱼的胚胎用系统水养殖 ,显微注射后24h以内的胚胎用郝氏液培养，24h后改用系统水养殖 ,7d后以草履虫喂养 ,14d后喂以丰年虫 ,2个月后放至循环水系统中用红线虫和丰年虫混合喂养。

1.12 原始质粒及菌株 Rag2-ICNI-EGFP原始质粒由 J Chen教授(哈佛医学院Dana-Farber癌症研究所肿瘤科)惠赠 ,pDsRed1-N1质粒购自Clontech公司。 E.coli菌株D H5α和 TOP10为 Tlangen公司产品。

1.1.3 主要试剂 各种限制性内切酶购自NEB公司;T4-DNA连接酶和反转录聚合酶链反应试剂均购自Promega公司;DNA长片段高保真聚合酶 LA Taq 购自TaKaRa公司;Tiangen QuantcDNA第一链合成试剂盒为Tiangen公司产品,引物均由上海博尚生物技术有限公司合成 ;质粒抽提试剂盒QiagenMaxi- PlepKit购自 Qiagen公 司;TRIzol试剂购自Lnvitrogen公司;细胞裂解液购于 Fermelltas公司 ,人源 ICNI抗体和斑马鱼内参抗体β -acun购自美国 AOGMA公司,细胞周期检测试剂盒为 TIANGEN公司产品。

1.1.4 主要仪器体视荧光显微镜 (NIKON SMZ- 1500)、显微注射系统 (Narishige IM300)和流式细胞仪 (BD FACS ARIA Ⅱ sORP,美国 )等均由南方模式生物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 构建Rag2-ICN1-RFP质粒 设计Rag2启动子前向 PCR引物和ICN1段后向 PCR引物 ,并在引物两端添加酶切位点 ,采用 PCR方法扩增出 Rag2+ ICN1长片段.。引物序列为上游引物;5’ -GTTAACCTCGAG CAAAATCAATCcTAATG-3’ (下划线部分为XhoⅠ酶切位点 ),下游引物 :5’ -GTTAAGCTTCTTGAAGGC CTCCGGAATGCG-3’ (下划线部分为HindⅢ酶切位点 )。 PCR程序 :94℃ 预变性 5min;%℃ 变性 30s、 8,7℃ 退火 1min、 72℃ 延伸 l1min,共 30个循环 ; 最后 72℃延伸 10min。 PCR产物长度约为 9.2kb, 跑胶后割胶纯化回收。 回收产物和质粒载体pDsRed1-N1均用 Xho1和 Hind Ⅲ 进行双酶切 ,并连接转化 ,克隆菌小量抽提质粒后用XhoI和Hind Ⅲ进行双酶切鉴定 ,将重组质粒送测序并验证无误。在证明重组质粒构建成功后 ,将重组质粒大量扩增抽提用于显微注射。

1.22 显微注射及转基因斑马鱼的筛选和建系

将重组质粒 Rag2-ICN1-RFP用XhoI线性化并且经纯化后显微注射到单细胞期的 fli1- EGFP斑马鱼胚胎中,使重组质粒的终质量浓度达到50 ~100ng /uL,每卵注射量约为 2nI丿。注射后将胚胎培养至 1个月左右,在荧光显微镜下将其胸腺处 RFP阳性的鱼挑出,并继续培养成为 FO代转基因斑马鱼(嵌合体)。在已性成熟的 FO代成鱼之间采取一对一形式交配产下的胚胎用同样的方法筛选出RFP阳性的 FI代转基因斑马鱼。

1.2,3 斑马鱼总 RNA提取及 cDNA制各 将胚胎或组织在 TRIzol中匀浆后 ,12O00∥m in离心 5min; 去除沉淀 ,加 人大约 1/5体积的氯仿,充分混匀后室温放置约15min;4℃ 下 12OO0× g离心 15min;将水相转移到另一新离心管 ,加人等体积的异丙醇混匀 , 室温下放置 15min;4℃ 下 12000× g离心 10min, 去除上清液。此 时可见白色 RNA沉淀 ,加入1mL 75%乙醇温和振荡 ,悬浮沉淀 ;4℃ 下 8OO0× g离心 5血n,去除上清液 ;室温干燥后用 DEPC处理 的去离子水溶解沉淀 ,测定其浓度后使用 Tiangen Quant cDNA第一链合成试剂盒制备 cDNA。 反应体系 :1× 超纯 dNTP(2.5mmo1/I,)2u1,,10× RT混合物 2uL, 随机引物 (10umol/L)2uL,模板 RNA2ug,Quant 反转录酶 l uL,无 RNase双蒸水补足至 ⒛ uL,37 ℃下孵育60min。所得 cDNA可直接用作 RT-PCR模版。

1.24 RT-PCR检测 ICN1mRNA的表达 以WT、 fli1-EGFP、 FO、 F1代 30dpf的 cDNA为模板 ,检测转基因 ICN1的表达。为避免与斑马鱼源性 Notch1基因发生交叉反应 ,引物序列为特异性针对人源性ICN1,具体引物序列见表 1。 RT-PCR反应体系 : cDNA1uL,引物 (20umol/L)1 uL,10× ExTaq缓冲液 2uL,dNTP(2.5umd/L)4uL,Et rrtg0· 5uL,去离 子 水 补 足 体 积 为 ⒛ uL。

1.2.5 Western blotting检 测 ICN1蛋白的表达 取斑马鱼组织加人细胞裂解液后匀浆 (冰上操作 ),高速离心后取上清并进行定量。取等量蛋白样品加人5×上样缓冲液 ,煮沸 10min，上样进行 SDS-PAGE电泳 ;电泳结束后用湿转法将蛋白转移至 PV DF膜上，装模电压 100Ⅴ 、60min;转移完成后 ,将 PVDF膜用去离子水冲洗 ,放入5%脱脂奶粉中,室温封闭 1h; 加入一抗 ,4℃ 孵育过夜。 TBST洗膜 3次 ,每次 10min;加人辣根过氧化物酶标记 的二抗 ,室温孵育1h,TBST清洗膜 3次 ,每次10min;ECI,化学发光法显影 、定影 ;以斑马鱼 β -actin作为内参 ,用 Image-Pro Plus图像分析系统对Western blotting条带进行蛋白表达的半定量分析。

1.2.6 流式细胞术 (flow cytometry,FCM)检测斑马鱼肾脏细胞周期及分群 麻醉后解剖斑马鱼取出肾脏 ,放人EDTA/肝素钠消化细胞 ,加预冷的 0.9× PBS+5%胎牛血清 (feta1bovine serum,FBS)1mL; 在 40um滤网上进行过滤 ;1OO0× g离 心 5-8min, 弃上清 ,收 集 1× 105个细胞 ;加 入 1mL PBS或 FBS再洗 1次 ,将沉淀细胞轻轻吹打均匀 ,加人预冷的 80%乙醇 ,终浓度 70%,4℃ 固定 18h以上 ;次日 ,上机前 1OO0√min离心 5min,弃固定液 ;加 1mI。 PBS 或 FBS洗 1次 ,加人碘化丙啶 (propidum iodide,PI) 染液 500uL(含 50ug/mIJ PI,100ug/mL RNase A), 4℃下避光处染色 (加 PI染液 0.5mL)30min;FCM 检测 :PI用氩离子激发荧光 ,激发光波长为 488nm, 发射光波长大于 630nm,产生红色荧光分析 PI荧光强度的直方图也可分析前 向角散射光 (1orward scatter, FSC)对侧向角散射光 (side scatter,SSC)的散点 图 , 其中 FSC代表细胞大小 ,SSC代表细胞粒度。

1.2.7 外周血涂片观察斑马鱼的红细胞和淋巴细胞比例 将fli1-EGFP斑马鱼和 F1代转基因斑马鱼 2个月成鱼分别置于 0.2mg╱ mL MS-222中成功麻醉后 ,在背鳍后部靠近背主动脉区域用剪刀做一侧切口0.3-0.5cm,见血液流出后用肝素化抗凝处理过的微量移液枪吸取血液制作外月血涂片若干张 ,待血涂片在空气中干燥后瑞氏一吉姆萨常规染色 ,采用油镜观察。

1.3 统计学处理

采用 SPSS18.0软件进行统计学处理。计量资料以x±s表示 ,两独立样本比较采用Student’s检验 ,P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 质粒的鉴定及转基因斑马鱼的筛选鉴定

Rag2-ICNl-RFP质粒在测序鉴定正确的基础上再进行双酶切鉴定 ,经 XhoI和HindⅢ 双酶切后产物进行 DNA凝胶电泳 ,结果酶切产物与Rag2+ICN1段、 pDsed1-N1长度相符合,分别对应9.2kb和 4,7kb，证明重组质粒构建正确 (图 1)。

将构建的质粒显微注射到单细胞期fli1-EGFP 品系斑马鱼胚胎中,结果在867条显微注射重组质粒的斑马鱼中,鉴定发现有 ⒛条(23%)转基因阳性斑马鱼 ,其中1个月左右胸腺表达 RFP的雄鱼9条 ,雌鱼11条 ,称为FO代转基 因斑马鱼。在筛选出的FO代成鱼之问采取一对一形式交配 ,产下的胚胎用同样的方法筛选出 RFP阳性的 F1代转基因斑马鱼。

2.2 验证转基因斑马鱼的表达

2.2.1 大体观培养 3个月后 ,在体视荧光显微镜下 Rag2-ICN⒈RFP/fli1- EGFP转基 因斑马鱼FO和 F1 代胸腺部位 RFP表达阳性 ,而fli1-EGFP斑马鱼未见 RFP的表达。EGFP的表达在转基因斑马鱼FO和 F1代以及fli1-EGFP鱼系中均有表达 (图 2)。

2.2.2 ICN1 mRNA的表达 以培养1个月的 WT、 Fli1-EGFP斑马鱼以及 FO和 F1代转基因斑马龟的 cDNA为模版检测ICN1 mRNA的表达,结果显示WT和fli1- EGFP斑马鱼表达为阴性 ,而 FO和 F1代转基因斑马鱼表达均为阳性 (图 3)。

2.2.3 ICM蛋白的表达 提取 30d的 WT、 Fli1- EGFP、 FO代的斑马鱼以及 3、7、 14、 30d的 F1代斑马鱼蛋白,用人源特异性抗体ICN1进行 Western blotting验证 ,结果显示WT和fli1-EGFP斑马鱼中无 ICN1蛋白的表达 ,而 FO代和F1代转基因斑马鱼中均有ICN1蛋白的表达 (图 4)。

2.3 斑马鱼肾脏细胞周期及分群

取培养 2个月斑马鱼的肾脏细胞进行 FCM检测 ,淋巴细胞周期分析显示：F1代转基因斑马鱼肾脏淋巴细胞 G2和 S期细胞较fli1-EGFP斑马鱼显著增高 ,并且F1代转基因斑马鱼在正常 G1峰前出现了亚Gl峰 ,统计学分析显示其凋亡细胞明显增多,差异有统计学意义 (P<0.01)(图 5A~C);细胞分群将肾脏内细胞划分为红细胞、淋巴细胞以及粒细胞 +单核细胞 3个细胞群,统计学分析显示:与皿1-EGFP斑马鱼比较 ,F 1代转基因斑马鱼红细胞明显减少,粒细胞 +单核细胞也有所降低 ,而淋巴细胞显著增加 (P<0.01)(图 5D)。

2.4 外周血涂片观察观察

培养 2个月的斑马鱼外周血涂片结果显示 , 与且fli1-EGFP斑马鱼相比,转基因 F1代斑马鱼红细胞比例明显降低 ,并且出现成簇的小淋巴细胞和一些原始细胞 ,与FCM检测结果一致 (图 6)。

3讨论

斑马鱼 (zebrassh,Dallio leho)是近年来新兴发展起来的用于研究脊椎动物肿瘤发病学和发育遗传学的一种模式生物[10-11]。作为一种重要的模式动物 ,其显著优势在于胚胎在体外受精、发育过程能直接连续观察;胚胎在发育早期呈透明,易于观察和操作 ;突变体的获得和单倍体、雌核发育二倍体的制作均比较容易 ;斑马鱼基因组测序已经完成 ,与人类基因组有85%的同源性,可方便地进行大规模诱变和突变型筛选等研究。

Notch基因于1919年在果蝇中被首先发现 ,随后的研究证实 Notch广泛存在于多个物种中,其家族成员在进化上高度保守 ,介导的信号通路更是参与了胚胎发育、血细胞发育以及肿瘤形成等多个病理生理过程 [12]。迄今为止 ,在脊椎动物体内共发现4种Notch基因 [13],它们编码了 4种单次跨膜受体蛋白,分别为 Notch1-4,其中 Nlltch1信号通路参与了正常 T细胞发育的各个阶段[6]。在淋巴细胞发育早期 ,进入胸腺的共同淋系前体细胞 (common lymphoid precmsors,CLP)只有在接受 Notch1信号后才可定向分化为 T细胞 ,反之则发育为 B细胞 [14]。当 CLP向 T细胞系定向分化形成原T(pro-J)细胞后 ,能促进 Pro-T细胞优先地向αβT细胞发育而不是向γδT细胞发育 [15]。 Notch1信号通路的激活经历三步水解形成胞内区活性部分ICN1后从细胞膜上游离出来 ,并最终转位到胞核内发挥作用。本研究FCM 检测结果显示 ,斑马鱼胚胎转人ICN1基因后 ,成鱼主要的造血器官肾脏内红系造曲明显受到抑制 ,T淋巴细胞的比例显著增加 ,处于G2和 S期的T淋巴细胞 比例也明显提高，并出现了亚 Gl峰。外周血涂片结果显示：与fli1-EGFP斑马鱼相比,转基因 F1代红细胞比例明显减少，并且出现成簇的小淋巴细胞和一些原始细胞 ,以上均提示 ICN1对于促进 T细胞增殖甚至恶性转化起到了积极作用。

Isog乩等[16]构建了fli1-EGFP转基因斑马鱼系 ,观察并比较了WT和突变体的斑马鱼 (fli1-EGFP)胚胎模型血管发育过程 ,为进一步鉴定分析调控血管发育相关分子提供了较好的工具。在本研究中,我们在该斑马鱼系 (Ⅲ1-EGFP)中 ,应用 Rag2启动子,驱动 IC NI基因并携带 RFP,建立了红绿双荧光示踪的双转基因斑马鱼T-ALL模型 ,至今为止尚未有人建立过此模型。本模型与2O07年 Chen[7]等建立的Rag2-ICN1-EGFP斑马鱼T-ALL模型相比，能较好地显示血管发生与T-AL L之间的位置关系。建系后的斑马鱼成龟在显微注射后一个月左右开始用荧光显微镜进行活体观察筛选 ,将同时有绿色荧光标记的血管网和红色荧光标记的白血病受累组织的成鱼挑选出来进一步验证。然后 ,我们又在 mRNA水平和蛋白水平验证了筛选的成鱼FO、 F1代中ICN1的表达。最后 ,用 FCM进行了阳性成鱼主要造血器官肾脏内的淋巴细胞周期分析和细胞分群分析 ,并进行了外周血涂片观察 ,说明 ICN1诱导的 T-ALL斑马鱼双荧光示踪模型已成功建立。本模型可用于在体实时动态观察 Notch信号通路异常激活对淋系造血和血管新生的影响。为今后研究 T-ALI,发病过程中血管形成的相关变化以及利用斑马鱼作为平台进行大规模药物活性成分体内实验筛选打下了基础。

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