实时定量PCR检测人白血病细胞hTERT mRNA的临床意

【摘要】目的利用实时荧光定量RT-PCR方法，检测白血病细胞人类端粒酶反转录酶(hTERT)的表达水平并探讨其临床意义。方法　采用基于TaqMan荧光技术的实时定量RT-PCR方法检测白血病患者骨髓单个核细胞及10种白血病细胞系hTERT mRNA拷贝数，来自同种基因移植供者的正常人骨髓细胞作为对照。结果　与28例正常人组相比，33例AML1/ETO融合基因阳性的急性髓性白血病(AML)患者骨髓细胞hTERT mRNA水平较高，中位数分别为8.96%(0.23%～76.73%)和 4.20%(0.21%～19.90%)(P<0.01)。47例B-ALL患者骨髓细胞hTERT mRNA水平中位数为20.80%(0.25%～1566.34%)，高于正常人组(P<0.001)及156例AML组(中位数为2.06%，范围为0～2133.41%)。70例慢性髓性白血病(CML)、36例M3型白血病患者hTERT mRNA水平中位数分别为0.57%(0～14.77%)、0.53%(0～11.10%)，均低于正常人组(P均<0.001)。15例治疗后达到完全缓解的急性白血病患者与初治时相比，hTERT mRNA水平明显下降，中位数分别为46.53%(8.96%～218.10%)和2.25%(0.18%～45.85%)(P<0.001)。10种白血病细胞系的hTERT mRNA水平差异甚大。结论　hTERT mRNA在人白血病细胞中的表达水平存在异质性。高表达hTERT mRNA可能是B-ALL及AML1/ETO阳性的AML发病机制中的因素之一。

　　【关键词】 白血病;　逆转录聚合酶链反应;　hTERT

　　【Abstract】　Objective　To investigate the clinical significance of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) messenger RNA expression in the leukemic cells by real-time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay.Methods　A real-time quantitative RT-PCR based on TaqMan fluorescence methodology was used to quantify the hTERT mRNA copy numbers in the bone marrow mononuclear cells from patients with leukemia and in ten human leukemic cell lines.Normal marrow samples from the allogeneic stem cell transplantation donors were served as control.Results　The expression level of hTERT mRNA was higher in the bone marrow mononuclear cells from 33 FAB(French-American-British，FAB)-M2 patients with AML1/ETO than that from 28 normal donors.The median value was 8.96%(0.23%-76.73%) and 4.20%(0.21%-19.90%)，respectively(P<0.01).The expression levels of hTERT mRNA from 47 B-ALL (median value,20.80%;range,0.25%-1566.34%) elevated significantly comparing with that from 156 AML at initial presention(median value,2.06%;range,0-2133.41%) and normal donors (both P<0.001).But it was lower in the bone marrow mononuclear cells from 70 CML(median value,0.57%;range,0-14.77%) and 36 FAB-M3 patients (median value　　0.53%;range,0-11.10%) than that from normal donors (both P<0.01).More over the expression median value from 15 patients with acute leukemia at complete remission reduced significantly than that from these patients at initial presention(46.53%,8.96%-218.10% vs. 2.25%,0.18%-45.85%，P<0.001).The expression levels of hTERT mRNA vary obviously in ten human leukemic cell lines.Conclusions　The expression level of hTERT mRNA is of heterogeneity in the leukemic cells.The up-regulation of the expression levels of hTERT mRNA may be one of the factors in the pathogenesis of B-ALL and AML with AML1/ETO.

　　【Key words】　Leukemia;　Reverse transcriptase polymerase chain reaction;　hTERT

　　端粒酶与肿瘤的发生密切相关，在肿瘤等永生化细胞中，端粒酶活性普遍高于正常组织细胞。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白复合体，其中人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是维持端粒酶活性必需的催化亚基，hTERT mRNA表达水平与端粒酶活性呈良好的正相关，其表达上调将导致端粒酶活性升高，在细胞的增殖、分化、衰老以及肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[1-3]。 在实体肿瘤如胃癌[4]、肺癌[5]及直肠癌[6]中已有较多的报道，并利用该特点用于靶向杀伤肿瘤细胞的研究[7-10]。在血液肿瘤方面，国内李一荣等[11]曾报道，hTERT mRNA表达水平与端粒酶活性的上调是急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)发生与复发的一个重要因素，本文旨在进一步应用实时定量PCR的方法观察hTERT在AML、慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukaemia，CML)及急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)中表达的差异。

　　对象与方法

　　一、研究对象

　　278例患者骨髓标本选自2007年3月至2009年9月在北京大学人民医院就诊的初诊病例，诊断标准依据FAB(French-American-British)分型标准[12]。包括AML 156例，其中按FAB分型M0 1例，M1 2例，M2 62例，M3 36例， M4 20例，M5 14例，M6 5例，FAB分类不明确的16例; ALL 52例， B-ALL 47例， T-ALL 2例;CML 70例，包括慢性期(chronic phase，CP)56例，加速(accelerated phase，AP)/急变期(blastic phase or blast crisis，BP/BC) 14例。其中15例急性白血病患者收集了治疗前及缓解后的标本(包括B-ALL 6例、AML 9例)。正常骨髓移植供者28例作为对照组。各类白血病基本临床特征见表1。

　　10种白血病细胞系K562、MEG-01、CEM、NB4、HL-60、KG1、Kasumi、Dami、HEL及U937由本所保存，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液常规培养，取对数生长期细胞用于RNA提取。表1　白血病患者基本临床特征

　　二、试验方法

　　1. RNA提取：所有患者骨髓及细胞系均提取细胞RNA。按TRIzol (Invitrogen公司，美国) RNA提取试剂盒说明书进行。无菌采集的骨髓标本，常规EDTA抗凝，用淋巴细胞分离液(相对密度1.077 g/L)分离出单个核细胞。分离出的单个核细胞或培养的各细胞系细胞用生理盐水洗涤2次后，加入 1 ml TRIzol试剂，剧烈震荡15 s后室温放置5 min，加入200 μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混匀，室温放置15 min,12 000 g(11 583 r/min) 4 ℃离心15 min后提取上层水相，加入等量异丙醇，-20 ℃保存。使用时，12 000 g(11 583 r/min) 4 ℃离心15 min后，收集沉淀的核酸，用70%的冷乙醇洗涤一次，室温干燥，加适量的含有RNAsin(400 U/ml)水溶解。在ND-1000分光光度计上检测其含量及纯度(NanoDrop 科技有限责任公司，美国)，所有用于实时定量RT-PCR的RNA样本的A260∶A280比率均>1.8。

　　2. RNA反转录：参照本室常规进行。在20 μl体系中，加入0.25 μg/μl随机引物(Promega，U.S.A.),1 U/μl RNAsin(华美生物技术公司，中国)，10 U/μl Mo-MLV反转录酶(Promega，U.S.A.)，每种dNTP 1 mmol/L(Pharmecia，U.S.A.)，最后加4 μg RNA(RNA样品预先于65 ℃，5 min后，置于冰上待用)。37 ℃反应2 h,95 ℃ 5 min灭活反转录酶，贮存于-20 ℃ 待用。

　　3. 引物及探针：hTERT 引物和探针序列合成参照文献[13]，内参基因ABL的引物和探针序列合成参照文献[14]。引物和探针总结见表2。

　　4. 实时定量PCR检测hTERT mRNA的表达水平：hTERT、内参基因ABL的扩增参照文献[13-14]进行。制备含ABL cDNA的质粒5个系列的稀释样本(105、104、103、102、10拷贝)，通过实时定量PCR扩增，得到绝对定量评估ABL拷贝数的标准曲线。由于扩增hTERT基因标准曲线的斜率(-3.52)与我们常规使用的内参基因ABL标准曲线的斜率(-3.46)相近，为减少实验的误差，未知样品hTERT的拷贝数参照ABL标准曲线计算，以hTERT拷贝数与ABL拷贝数比值的百分数(hTERT/ABL×100%)表示hTERT基因的相对表达水平。

　　实时定量PCR利用ABI 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems，USA) 完成。PCR 条件是 50 ℃，2 min;95 ℃，10 min;接着是95 ℃，15 s;60 ℃，1 min;40 个循环，PCR 反应体系为10 μl，包括1×TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)5 μl,1 μl cDNA,300 nmol/L引物，200 nmol/L(ABL)或150 nmol/L(hTERT)探针。

　　三、统计学分析

　　统计分析采用SPSS 13.0软件。白血病患者与正常人数据比较、治疗前后数据比较采用Mann-Whitney U检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

　　结　　果

　　1. 白血病细胞系hTERT的表达水平：白血病细胞系KG1、Kasumi、NB4、HL-60、U937、HEL、Dami、K562、MEG-01及CEM的hTERT mRNA两次测定的平均水平分别为13.72%、59.31%、0.47%、18.69%、5.39%、4.94%、9.85%、9.36%、1.51%及204.13%。

　　2. AML患者骨髓细胞hTERT的表达水平(表3)：156例AML组骨髓细胞的中位hTERT mRNA水平明显低于28例正常对照组，但其中AML1/ETO(+)M2 组的hTERT mRNA水平却明显高于正常对照组[8.96%(0.23%～76.73%)vs. 4.20% (0.21% ～19.90%)，P=0.008]。其余各AML亚型的hTERT mRNA水平均低于或接近于正常对照组。

　　3. B-ALL骨髓细胞hTERT的表达水平：Ph(+)ALL患者骨髓细胞hTERT mRNA水平高于正常人，中位数分别为21.49%(0.33%～362.33%)、4.20%(0.21%～19.90%)，约是正常人的5倍(P=0.034)。B-ALL患者骨髓细胞hTERT mRNA水平明显高于AML组，中位数分别为20.80%(0.25%～1566.34%) 和 2.06%(0～2133.41%)(P=0.000)。Ph(+)ALL与Ph(-)ALL相比，hTERT mRNA水平差异无统计学意义(P=0.386)。表2　实时定量PCR检测表3　实时定量PCR检测hTERT在白血病患者和正常人骨髓细胞中的表达水平

　　4. CML骨髓细胞hTERT的表达水平(表3)：CML患者hTERT mRNA水平低于正常人，表达中位数分别为0.57%(0～14.77%)、4.20% (0.21%～19.90%)(P=0.000)。初治CML-CP与CML-AP/BC组hTERT mRNA水平相比差异无统计学意义(P=0.860)。

　　5. 治疗前后hTERT表达水平的差异：跟踪15例初治时hTERT mRNA水平在8.50%(2倍正常对照组中位值)以上的急性白血病，其中B-ALL 6例，AML 9例。结果如图1所示，15例患者治疗后hTERT mRNA水平明显下降，中位值由初治时的46.53%(8.96%～218.10%)下降至缓解时的2.25%(0.18%～45.85%)(P=0.000)。

　　讨　　论

　　端粒酶是肿瘤细胞实现永生化的关键酶，在多种肿瘤细胞中高表达，其活性主要受hTERT调控，hTERT mRNA的表达上调将导致端粒酶活性升高，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[1-3]。de-Kok等[15]曾对部分正常组织与肿瘤细胞株的hTERT mRNA进行实时定量检测，结果发现大部分正常组织如肺脏、肝脏、胰腺、前列腺、膀胱、肾脏以及脑与尿道不表达hTERT mRNA，睾丸、骨髓hTERT mRNA 表达水平较高，而同时检测的黑色素瘤细胞株以及膀胱癌hTERT mRNA的表达水平明显升高。目前，也有研究表明hTERT的表达不仅与细胞的端粒延长及细胞永生化有关，而且可通过降低细胞活性氧簇(ROS)水平使肿瘤细胞逃避死亡刺激[16]。

　　我们采用实时定量RT-PCR方法对156例初治AML患者骨髓单个核细胞及28例正常供者的hTERT水平进行了检测，结果发现AML初治患者hTERT的表达存在较大异质性，其总体表达水平低于正常对照组，这与文献中对AML病例研究的结果不符[17-18]，考虑到AML是一组在细胞和分子遗传学上存在高度异质性的疾病，我们进一步按FAB分型分别分析AML各亚型的hTERT mRNA的表达，结果发现AML1/ETO融合基因阳性的M2型AML患者骨髓细胞中hTERT水平高于正常人水平(中位值约为正常人的2倍)，且高于AML1/ETO阴性的M2及其他AML各亚型患者，提示hTERT的表达在AML1/ETO基因阳性M2的发生发展中发挥一定作用。47例B-ALL患者骨髓细胞hTERT mRNA水平明显高于正常人，其中位值约为正常人的5倍，这与文献报道的结果一致[19-20]。Ph阳性ALL与Ph阴性ALL的hTERT表达均高于正常对照组，但Ph阳性及阴性组之间差异并无统计学意义。此外，15例初治时高表达hTERT mRNA(大于正常中位值2倍以上)的急性白血病患者，治疗后达到完全缓解时的hTERT mRNA水平明显下降，与文献报道的结果相近。

　　Iwama等[21]曾报道CML-AP/BC患者骨髓细胞中端粒酶活性明显升高，而Campbell等[22]研究发现，CML-CP及CML-AP/BC患者CD34+ 造血干细胞的hTERT表达均明显下调。我们的结果没有显示CML-AP/BC与CML-CP患者之间hTERT的表达存在差异，也没有发现CML-AP/BC患者hTERT的表达高于正常对照组。这是否与CD34+ 造血干细胞hTERT表达降低有关尚有待于进一步研究。

　　我们对人白血病细胞系进行hTERT mRNA水平检测的结果也表明，hTERT mRNA在人白血病细胞中的表达水平存在异质性，在ALL细胞系CEM中最高(204.13%)，在AML1/ETO融合基因阳性的细胞系Kasumi中其次(59.31%)，在M3细胞系NB4中最低(0.47%)，与临床AML各亚型相应。高表达hTERT 基因可能激活端粒酶，而端粒酶的激活能使肿瘤细胞获得无限增殖的能力，是肿瘤发生、发展的关键性步骤[23]，白血病各型间和同型间hTERT 基因的表达差异较大，可能反映了个体肿瘤细胞无限增殖的能力不同，高表达hTERT mRNA可能是某些白血病如ALL、AML1/ETO阳性的AML发病机制中的因素之一。是否与白血病的复发、预后相关值得进一步的研究。

　　志谢　感谢北京大学人民医院血液病研究所同仁在收集标本与提供病例资料方面的支持

　　(本文图片见光盘)

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