DNA片段长度分析检测急性髓性白血病CEBPA 基因突变

　　作者：阮国瑞,牛继红,李玲娣,张瑶,李金兰　　作者单位：100044　北京大学人民医院血液病研究所

　　【摘要】目的建立检测急性髓性白血病(AML)髓系转录因子CCAAT增强子结合蛋白-A(CEBPA)基因突变的快速筛查方法。方法　采用聚合酶链式反应(PCR)扩增产物片段长度分析及序列分析方法检测107例初治AML患者CEBPA基因全部编码区突变情况。来自同种基因移植供者的38例正常人作为对照。结果　同时用测序及片段长度分析的方法检测了107例AML患者及38例正常人CEBPA突变的情况，在排除了已知的多态位点以后，在107例AML患者中筛查出22例患者存在CEBPA突变，其中4例患者存在2种CEBPA突变，18例患者存在1种CEBPA突变，而在38例正常人中没有发现CEBPA突变。与测序结果比较，片段长度分析检测CEBPA突变是敏感和有效的。结论　片段长度分析是一种快速、敏感地筛查CEBPA基因突变的方法，适合常规的AML诊断。

　　【关键词】 白血病，粒细胞，急性;　CCAAT增强子结合蛋白α;　聚合酶链式反应;　序列分析，DNA

　　【Abstract】　Objective　To establish a rapid screening method for CEBPA(CCAAT-Enhancer Binding Protein-alpha，CEBPA)mutations.Methods　We detected mutations throughout the entire coding region of the CEBPA gene in 107 untreated AML patients using polymerase chain reaction (PCR) followed by sequence analysis and fragment length analysis.Thirty-eight normal donors from the allogeneic stem cell transplantation were served as control.Results　We evaluated the approach by analysing 107 AML patient and 38 normal samples by both fragment length analysis and nucleotide sequencing.Twenty-two cases with CEBPA mutation were found in 107 AML patients after excluding all known CEBPA polymorphisms.Of 4 CEBPA mutated patients had two mutations and 18 patients had a single mutation.No mutation was found in 38 normal samples.CEBPA mutation detection by fragment length analysis is sensitive and efficient when compared to nucleotide sequencing.Conclusions　We established a fast and sensitive CEBPA mutation screening method for routine AML diagnostics.

　　【Key words】　Leukemia，myelocytic，acute;　CCAAT-enhancer-binding protein-alpha;　Polymerase chain reaction;　Sequence analysis，

　　DNA急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)是由髓系造血干/祖细胞发生累积性获得性基因改变导致正常的细胞增殖、分化和凋亡而发生改变的一种恶性疾病，是成人急性白血病的主要类型，分类复杂，发病机制至今尚不明确，在临床及遗传学上均具有显著异质性。成人AML患者中大约55%可鉴定出细胞遗传学异常，大约45%的AML患者表现为正常核型[1-2]。最新公布的WHO白血病分类标准[3]中，强调在初诊评估时就应对骨髓样本进行全面的细胞遗传学分析，特别是NPM1、CEBPA和FLT3突变，在新修订的分类标准中已成为AML重要的预后参考指标，可能成为新的治疗靶点。NPM1和FLT3突变已成为常规诊断项目，而CEBPA(CCAAT增强子结合蛋白A)突变类型多样，且突变分布在CEBPA基因的全部编码区、序列片段长、GC含量高，尽管核苷酸测序是检测基因突变的金标准，但针对CEBPA突变的测序耗时长、难度大、费用高，需要开发新的筛查方法[4]。我们在对107例AML患者及38例正常人测序的基础上，建立了针对CEBPA基因全部编码区的一种快速、简便、敏感的筛查方法，介绍如下。

　　对象与方法

　　1. 研究对象：AML患者107 例，选自2007年1月至2010年1月在北京大学人民医院就诊的初诊病例，均为染色体核型正常者，其中男61例，女46例，年龄15～86岁，中位年龄42岁。诊断标准依据世界卫生组织新的分型标准[3]。正常骨髓移植供者38例作为对照组。

　　2. 待测样品制备：107份患者骨髓标本及38例正常人骨髓或外周血标本，参照DNAzol 试剂盒(Invitrogen公司)说明书在无菌条件下提取基因组DNA，方法为：用Na2EDTA抗凝，用淋巴细胞分层液(相对密度1.077 g/L，上海华精高科技有限公司)分离出单个核细胞，将分离出的单个核细胞用生理盐水洗涤2次后，加入600 μl DNAzol试剂，参照试剂盒说明书提取DNA，在ND-1000分光光度计上检测浓度 (NanoDrop 科技有限责任公司)，所有用于PCR的DNA样本的A260∶A280比值均>1.8。

　　3. PCR 扩增CEBPA基因：实验中扩增CEBPA基因全部编码区所用的引物序列参照文献[4]合成，4对荧光标记的引物序列见表1，同时合成不携带标记基团的4对引物，引物序列同表1。以待测者的DNA为模板，分别用以上4对荧光标记的引物或不携带标记基团的4对引物进行扩增，分别可以得到4种扩增产物，覆盖CEBPA基因全部编码区，其中利用不含荧光标记的引物扩增的产物用于测序分析，利用含荧光标记的引物扩增的产物用于片段长度分析。

　　PCR 混合体系中包括2×Universal PCR Mastermix (天根生物技术有限公司，北京),400 nmol/L引物和150～500 ng的DNA。扩增1～3片段时，PCR 步骤如下：95 ℃变性5 min;接下来是 95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共35个循环;最后 72 ℃延长 7 min。扩增4片段时，PCR 步骤如下：95 ℃变性5 min;接下来是 95 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共35个循环;最后 72 ℃延长7 min。

　　4. 序列分析：PCR扩增产物1～4经纯化后，由上海基康有限公司分别利用下游引物在ABI3700 DNA分析仪上完成测序工作。测序结果与美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库序列(NM_004364.2)进行比对。

　　5. 片段长度分析：含荧光标记的引物扩增的产物1～4用于片段长度分析。在ABI PRISM? 3730 DNA 分析仪上，使用GeneScan程序电泳，电泳数据经Genemapper 软件( 3.7版)处理后得到检测片段大小，其中产物1、2或产物3、4可同时进行片段长度分析，见表1。　　表1　检测CEBPA基因突变的引物

　　结　　果

　　1. 测序与片段长度分析筛查CEBPA基因突变结果的比较：在107例AML患者DNA样本中，测序检查发现CEBPA基因突变22例，其中4例患者存在2种CEBPA突变，18例患者存在1种CEBPA突变，共26个突变位点，均为插入或缺失突变，且均可被片段长度分析的方法检出，而在38例正常人中除多态位点外均未检出CEBPA基因突变。如图1所示，图1A为1位正常人CEBPA基因全部编码区的4个扩增产物片段长度分析的结果;图1B、1C分别为编号6、编号13患者的CEBPA基因4个扩增产物片段长度分析的结果，前者扩增产物1、产物3分别存在1个碱基的插入及缺失，后者扩增产物1、产物4分别存在1个及41个碱基的插入。图2示AML患者CEBPA基因突变序列分析的结果，图2A、2B分别为编号6患者扩增产物1、产物3的测序结果。图2C、2D分别为编号13患者扩增产物1、产物4的测序结果。

　　2. 测序与片段长度分析CEBPA基因多态位点的结果比较：在107例AML患者DNA样本中，测序检查发现33例存在CEBPA基因(扩增产物3)第584～589位多态性位点(ACCCGC重复序列，图3A)，在38例正常人DNA样本中，发现8例存在该多态性位点。在所测的所有样本扩增产物3的测序结果中，没有发现除了该6个ACCCGC碱基重复序列以外的6个碱基的插入或缺失。在片段长度分析扩增产物3的结果中，筛查出的6个碱基的插入样本测序结果均证实为该多态位点(图3B)。

　　3. 测序与片段长度分析CEBPA基因突变阳性患者结果的比较(表2)：经测序与片段长度分析22例CEBPA基因突变阳性患者结果的比较，测序检查的结果可与NCBI基因库序列 NM_004364.2比对，结果显示为没有发现异常，或在确定的位点处显示为插入、缺失及置换突变等;片段长度分析结果显示为与野生型扩增片段大小相比，没有发现片段大小异常，或与野生型扩增片段大小相比，该片段插入、缺失1个碱基及1个碱基以上的片段大小的改变。测序检查发现的CEBPA基因突变22例，共26种CEBPA基因突变位点，均表现为插入或缺失突变，且均可被片段长度分析的方法检出。其中在7例患者扩增产物3中发现存在插入6个碱基的扩增产物，测序结果显示为584～589 位ACCCGC重复序列多态位点。

　　讨　　论

　　由基因突变导致的细胞增殖、分化和细胞凋亡表2　测序与片段长度分析22例CEBPA基因突变阳性患者结果的比较

　　途径的改变是AML的发病基础。其中CEBPA在造血系统中只表达于髓系细胞，是髓系祖细胞增殖与分化过程中一个重要的转录因子，具有诱导粒系的分化和抑制增生的作用。CEBPA突变的检测在AML患者的诊断、分层、预后评估及治疗方案选择中具有重要意义，但针对此突变的筛查有一定难度，原因是：(1)CEBPA基因编码358个氨基酸[5]，无内含子，序列片段长，GC含量高，突变分布在该基因的全部编码区。(2)突变类型多样，可能是一种或多种突变同时出现。尽管核苷酸测序是检测基因突变的金标准，但针对CEBPA基因全部编码区的测序需分4个片段，由于GC含量高，测序难度大、耗时长、费用高，且一次测序难以保证在一定的时间内每个样本都能得到测序的满意结果，不适合大规模的或常规分析。

　　我们在对107例正常核型AML患者该基因全部编码区测序检查发现22例突变的基础上，初步建立了PCR扩增产物片段长度分析的方法，可敏感准确地检测出1个碱基的缺失或插入突变。在排除已知的多态位点以后，测序结果与片段长度分析的结果一致，在107例AML患者中，两种方法均可发现22例CEBPA基因突变，共26种突变位点。此外，CEBPA基因第584～589位6个碱基的重复序列已报道为多态性位点[6-7]，我们片段长度分析的结果发现107例AML患者中33例、38例正常人中8例，在扩增产物3中存在6个碱基的插入，测序结果均证实为该多态位点，在所测的所有样本扩增产物3的测序结果中，没有发现除了该位点以外的6个碱基的插入或缺失。

　　PCR扩增产物片段长度分析是一种快速、简便、准确地筛查CEBPA基因突变的方法，重复性好、成本低，可替代测序用于CEBPA基因突变的筛查。但应注意在判定CEBPA基因突变时，应排除已知的多态性位点，特别是检出率较高的第584～589位多态性位点，从表2的结果分析，该多态位点与其他片段CEBPA突变并存的百分率为31.8%(7/22)，这些病例可直接报告为突变阳性，而对于单一出现的产物3中6个碱基的插入，不应认为是突变，必要时应测序验证。片段长度分析方法的缺点是不能鉴别单碱基置换造成的突变或多态位点，我们对107例AML患者测序的结果进行了分析，没有发现单碱基置换造成的突变，两种方法均可发现26种CEBPA基因突变位点。但Benthaus等[4]总结了已报道的对CEBPA基因全部编码区检测所发现的单碱基置换， 在总数为1295例的患者中，发现15例存在单碱基置换，其中7 例有另外的影响片段长度的突变，只有8例是单一的单碱基置换造成的突变，估计片段长度分析CEBPA基因突变的假阴性率是0.62%，可鉴定99.38%的CEBPA突变。

　　总之，片段长度分析CEBPA基因突变是一种快速、简便、敏感的筛查方法，适合于大规模检测或常规AML诊断，可用于临床上分子分型、个体化诊断和预后预测，为患者选择合适的治疗方法提供依据。

　　(本文图片见光盘)

　　【参考文献】

　　[1]　Slovak ML，Kopecky KJ，Cassileth PA，et al.Karyotypic analysis predicts outcome of preremission and postremission therapy in adult acute myeloid leukemia：a Southwest Oncology Group/Eastern Cooperative Oncology Group Study.Blood,2000,96(13)：4075-4083.

　　[2]　Byrd JC， Mrózek K，Dodge RK，et al.Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success，cumulative incidence of relapse，and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia：results from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461).Blood,2002,100(13)：4325-4336.

　　[3]　Swerdlow SH，Campo E，Harris NL，et al.WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.4th ed.International Agency for Research on Cancer(IARC)France，Lyon：2008.

　　[4]　Benthaus T，Schneider F，Mellert G，et al.Rapid and sensitive screening for CEBPA mutations in acute myeloid leukaemia.Br J Haematol,2008,143(2)：230-239.

　　[5]　Trivedi AK，Bararia D，Christopeit M，et al.Proteomic identification of C/EBP-DBD multiprotein complex：JNK1 activates stem cell regulator C/EBPalpha by inhibiting its ubiquitination.Oncogene,2007,26(12)：1789-1801.

　　[6]　Lin LI， Chen CY， Lin DT， et al.Characterization of CEBPA mutations in acute myeloid leukemia：most patients with CEBPA mutations have biallelic mutations and show a distinct immunophenotype of the leukemic cells.Clin Cancer Res,2005,11(4)：1372-1379.

　　[7]　Fuchs O，Provaznikova D，Kocova M，et al.CEBPA polymorphisms and mutations in patients with acute myeloid leukemia，myelodysplastic syndrome，multiple myeloma and non-Hodgkin′s lymphoma.Blood Cells Mol Dis,2008,40(3)：401-405.