白细胞新单克隆抗体ZCH-2B8a的表达谱分析及其意义

　　作者：汤永民,郭莉,杨世隆,沈红强　　作者单位：浙江大学医学院附属儿童医院血液肿瘤科，杭州 310003;基金项目：浙江省自然科学基金，编号：398427;卫生部科研基金，编号：98-1-332

　　【摘要】ZCH-2B8a (IgG2a )是作者研究室最近采用髓细胞性白血病细胞系KG1a作为免疫原自行研制的鼠抗人造血细胞分化抗原的单克隆抗体，已提交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(HLDA8)鉴定。根据HLDA8总部反馈信息表明，该抗体识别的抗原性质不明，后者属国际上尚未认识的血细胞膜新的分化抗原。本研究旨在分析ZCH-2B8a单克隆抗体与正常人外周血细胞成分、骨髓及G-CSF动员的外周血CD34+造血干/祖细胞和血液肿瘤细胞系的反应规律及其意义。 采用多参数流式细胞术分析2B8a抗体与正常及恶性肿瘤细胞表面的反应性，每种细胞成分重复实验3次，以阳性细胞数≥20%为阳性。结果表明： 2B8a抗原在外周血B细胞上表达(3/3例，平均阳性细胞数为26.29 %)，而在T淋巴细胞和NK细胞上不表达(0/3例);在粒细胞和单核细胞上阳性表达均为2/3例，平均阳性细胞数分别是23.72 %和59.84 %;在DC细胞、红细胞和血小板上均不表达(0/3例)。2B8a抗原在骨髓CD34+细胞上的阳性表达是3/3例，平均阳性细胞数39.33 %，而在G-CSF动员的外周血CD34+细胞上的阳性表达仅1/3例，平均阳性细胞数为1.25 %。2B8a抗原在B系细胞系Raji、SMS-SB、Nalm-6和Nall-1上的平均阳性细胞数分别为98.78 %、98.61 %、94.93 % 和5.68 %;在T系细胞系Molt-3上的平均阳性细胞数为31.40 %，而在Molt-4、JM和CCRF-CEM 细胞上不表达;在髓系细胞系U937、Meg-01、HL-60、K562、KG1a和HEL92.1.7上的平均阳性细胞数分别为67.78 %、33.40 %、29.70 %、28.19 %、16.23 %和8.02 %;在神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH、KCNR、BE、LAN-1和SK-N-AS细胞以及结肠癌细胞系HR8348细胞上均不表达，而在羊膜细胞系FL细胞上呈一定的阳性表达，平均阳性细胞数为45.03%。结论： 在正常外周血，2B8a抗体主要与B淋巴细胞和单核巨噬细胞反应，在骨髓和外周血CD34+造血干/祖细胞中也有不同程度的反应性;在细胞系上，2B8a抗体主要与B系细胞系、单核巨噬细胞系及上皮性肿瘤细胞系反应，提示该抗体有可能用于上述肿瘤的免疫学诊断与治疗。

　　【关键词】 ZCH-2B8a抗体; 白细胞单克隆抗体; 造血干/祖细胞; 白血病，淋巴瘤

　　Reactivity of a Novel Monoclonal Antibody ZCH-2B8a on Normal Hematopoietic Cells and Malignant Cell Lines and Its Significance　TANG Yong-Min, GUO Li, YANG Shi-Long, SHEN Hong-Qiang, QIAN Bai-Qin, ZHANG Yi, ZHANG Hai-Zhong　Department of Hematology and Oncology, Children Hospital, Medical College, Zhejiang University, Hangzhou 310003, China

　　AbstractsZCH-2B8a (IgG2a ) is a novel monoclonal antibody (McAb) generated in laboratory of Children Hospital of Medical College, Zhejiang University recently using human myeloblastic leukemia cell line KG1a as immunogen. This antibody has been submitted to the 8th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA8) and the results showed that the antibody recognized an unknown molecule on the surface of some blood cells. The aim of this study was to investigate the reactivity of this antibody on normal blood cells and malignant cell lines and to explore its possible application in clinical practice. The multi-parameter flow cytometry was used to analyze the expression pattern of 2B8a antigen in triplicate on normal blood components including T cells, B cells , natural killers (NK), neutrophils, monocytes, dendritic cells (DC), red blood cells (RBC), platelets (Plt), hematopoietic stem/progenitor cells derived from either bone marrow or G-CSF mobilized peripheral blood CD34+ cells and malignant cell lines including 14 hematopoietic, 5 neuroblastoma, 1 colon cancer and 1 amniotic epithelium cell lines. The amount of positive cells ≥20% was considered as positivity. The results showed that 2B8a antibody reacted to 3/3 specimens of blood B cells with a positive rate of 26.29% and 2/3 specimens of monocytes with an average positive rate of 59.84%. 2B8a was weakly reactive to neutrophils (23.72%) and negative for T cells, NK, DC, RBC and Plt. The antibody reacted to all 3 marrow CD34+ cells with an average positive rate of 39.33% while it was negative for G-CSF-mobilized CD34+ peripheral blood stem/progenitor cells (PBSC, 1.25%). Cell line analysis showed that the antibody notably reacted to three out of 4 cell lines (Raji, SMS-SB, Nalm-6 and Nall-1) with the positive rates of 98.78%, 98.61%, 94.93% respectively and weakly to one of them with 5.68% in B lineage cell lines and monoblastic cell line (U937, 67.78%) while it was only weakly positive or negative for other myeloid leukemia cell lines including Meg01 (33.40%), HL-60 (29.70%)，K562 (28.19%), KG1a (16.23 %) and HEL92.1.7 (8.02%). Among 4 T lineage leukemia，5 neuroblastoma and 1 colon cancer cell lines tested, only Molt-3 was found weakly positive (31.40%) for 2B8a, while the remaining 3 T cell lines (Molt4, JM and CCRF-CEM), 5 neuroblastoma cell lines (LA-N1, KCNR, BE, SK-N-SH, SK-N-AS) and the colon cancer cell line (HR8348) tested were negative. An amniotic epithelium cell line (FL) was showed positive for the antibody (45.03%). It is concluded that 2B8a antibody primarily reacts to B lineage and monocytic lineage cells which may bear the diagnostic and therapeutic applications among different types of hematopoietic malignancies.

　　Key wordsZCH-2B8a antibody; leukocyte monoclonal antibody; hematopoietic stem /progenitor cell; leukemia; lymphoma

　　白细胞膜抗原抗体研究对血液系统肿瘤的诊断、分型、微小残留病(MRD)的监测以及靶向治疗均具有十分重要的意义和广阔的应用前景[1-7]。ZCH(Zhejiang Children Hospital)-2B8a是本科研究室自行研制的鼠抗人造血细胞分化抗原的单克隆抗体，已经提交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(HLDA8)鉴定。根据HLDA8总部大量研究的反馈信息表明，该抗体识别的抗原性质不明，属国际上尚未认识的血细胞膜新的分化抗原[8]。为了进一步明确2B8a抗体的抗原识别特性，我们应用多色流式细胞术检测2B8a抗原在正常人外周血细胞、外周血和骨髓CD34+造血干/祖细胞以及各种细胞系细胞上的表达，现将初步结果总结报道如下。

　　材料和方法

　　ZCH-2B8a杂交瘤细胞株的建立

　　以人原始髓细胞白血病细胞系KG1a作为免疫原，采用经典杂交瘤技术[9]将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，经选择培养液培养后和KG1a细胞筛选，获得1株与KG1a细胞呈弱阳性反应的细胞系，命名为ZCH-2B8a(简称2B8a)。经3次以上亚克隆培养，建立了能稳定分泌2B8a抗体的杂交瘤细胞系。该抗体经用抗小鼠免疫球蛋白亚类试剂盒和流式细胞仪(FCM)分析，证实为IgG2a 抗体。以培养上清(滴度1∶16)作为抗体来源进行研究。

　　正常细胞来源

　　正常外周血细胞成分的分离选择本实验室身体健康的年轻志愿者3名，分别抽取其外周静脉血15 ml, 肝素钠抗凝。经180×g离心5分钟分离血浆和血细胞，取血浆部分移入另一试管中，经1800× g离心20分钟，弃上清，沉淀物作为血小板的来源，悬浮于适量的含5%小牛血清的RPMI 1640 培养液中备用。血细胞部分用10 ml培养液稀释后，分别加入终浓度为1.5%的羟乙基淀粉(Hespan, 美国Baxter公司产品)，放入37℃水浴锅中孵浴1小时，使之自然沉降，取上层液体部分作为白细胞的来源，经磷酸盐缓冲液(PBS， 0.01 mol/L, pH 7.4) 离心洗涤2次后，用含5%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液适量，制成细胞悬液，调细胞浓度至107/ml备用。下层作为成熟红细胞的来源，同上RPMI 1640培养液悬浮制成细胞悬液并调细胞浓度为107/ml备用。

　　正常骨髓及MNC分离经家长同意，取本院住院特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿骨髓3人份，各2 ml, 肝素钠抗凝，以淋巴细胞分离液(比重1077)常规分离MNC，PBS离心洗涤2次后，用上述培养液重悬浮制成MNC悬液，调细胞浓度为107/ml备用。

　　正常外周血干/祖细胞制备及MNC分离取经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的正常同胞外周血干/祖细胞(PBSC)3例次，各0.5 ml，以上述培养液稀释，制成细胞浓度为107/ml的细胞悬液备用。

　　细胞系

　　B系细胞系Nall-1，SMS-SB，Nalm-6，Raji购自美国ATCC公司，冻存于本研究室液氮中。复苏后加入10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃、 5% CO2、饱和湿度培养箱中常规培养扩增细胞，收集足够的细胞，经洗涤后，用0.4%台盼蓝计数活细胞，细胞存活率在95%以上，制成单细胞悬液，调细胞浓度为107/ml备用。

　　T系细胞系CEM、JM、Molt-4、Molt-3购自美国ATCC公司，冻存于本研究室液氮中，经复苏后同上培养及细胞悬液制备备用。髓系细胞系Meg-01(巨核细胞白血病细胞系)、KG1a(原始粒细胞白血病细胞系)、U937(单核细胞白血病细胞系)、HL-60(早幼粒细胞白血病细胞系)、K562、HEL(红白血病细胞系)购自美国ATCC公司，冻存于本研究室液氮中，经复苏后同上培养及制成细胞悬液备用。

　　神经母细胞瘤细胞系LAN-1、KCNR、BE由美国南加州大学医学院Reynolds教授惠赠，SK-N-AS、SK-N-SH购自美国ATCC公司，冻存于本研究室液氮中，经复苏后用上述培养液进行贴壁细胞培养，待细胞达到90%培养瓶底覆盖时，采用0.2%胰酶/EDTA液消化分散细胞，台盼蓝计数细胞存活率达85%以上者用于实验，以同上培养液进行贴壁培养及细胞悬液制备后备用。

　　结肠癌细胞系HR8348引自浙江大学肿瘤研究所，按上述方法扩增培养并制成细胞悬液备用。

　　羊膜细胞株FL引自浙江大学医学院病理教研室，用同上述方法扩增培养和处理后备用。

　　抗体

　　2B8a抗体来源于该杂交瘤细胞的培养上清，抗体滴度达1∶16以上。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠免疫球蛋白(GAM)购自美国KPL公司。CD3-APC、CD19-PE、CD56-PE、CD34-PE、CD38-APC、CD33-APC、CD14-PE、CD66b-PE、CD45-PerCP、HLA-DR-PerCP、Glycophorin A-PE、CD41-PE及各种荧光素标记的同型阴性对照抗体均购自美国Becton Dickinson公司。

　　染色方法

　　取上述各种细胞成分，每管106细胞，设同型阴性对照1管。经AB血浆孵育以阻滞Fc受体后，分别加入2B8a抗体上清50 μl，混匀后室温反应20分钟，用PBS洗涤1次，加入FITC-GAM 0.5 μg，4℃避光反应20分钟，用PBS洗涤2次。对细胞系分析管直接行流式细胞术(FCM)分析，其余细胞成分分析管分别加入如下相关直接标记的荧光抗体以选择相应细胞群：T细胞管加入CD3，B细胞管加入CD19, NK细胞加入CD3和CD56，DC细胞管加入HLA-DR、CD33、CD14、CD56[10]， 单核细胞管加入CD14， 粒细胞管加入CD66b，红细胞管加入GPA, 血小板管加入CD41，造血干/祖细胞管加入CD45、CD34、CD38。避光室温反应20分钟后，用FACS 溶血剂每管1 ml室温避光溶血10分钟，以PBS洗涤2次，用500 μl PBS重悬浮细胞行FCM分析。

　　流式细胞术分析

　　采用美国Becton Dickinson公司的FACScalibur流式细胞仪和CellQuest 3.1软件获取数据，外周血细胞成分分析获取10 000个细胞，造血干/祖细胞获取60 000个细胞，储存于电脑记忆体中。根据阴性对照分析抗原的表达情况。以≥20%阳性细胞数作为阳性标准[10]。

　　统计学分析

　　以重复3次结果的中位数表示。

　　结果

　　2B8a抗原在外周血细胞上的表达

　　共计检测3例正常人外周静脉血标本，2B8a抗原在外周血B、T淋巴细胞和NK细胞上的阳性表达分别为3/3例、0/3例和0/3例，阳性细胞率分别为26.29%、0.70% 和179%;在粒细胞和单核细胞上的表达均为2/3，阳性细胞率分别是23.72% 和59.84%;在外周血髓样树突状细胞(DC)、红细胞和血小板上均不表达(0/3例)，阳性细胞率分别为8.96%、0.38%和0.20%(表1)。由此可见，2B8a抗原主要在B细胞、单核细胞表达，在粒细胞上低表达，在其他外周血细胞成分表面不表达。Table 1. Reactivity of 2B8a antibody to normal peripheral blood cells (略)

　　2B8a抗原在CD34+造血干/祖细胞及其亚群上的表达

　　2B8a抗原在3例骨髓总CD34+细胞上均有不同程度的表达(3/3例)，阳性细胞率39.33%;在CD34+CD38+和CD34+CD38-细胞的阳性表达分别为1/3例和2/3例，阳性细胞率分别为13.58 % 和20.42 %。而在G-CSF动员的外周血干/祖细胞，2B8a抗原仅在1/3例的总CD34+细胞上表达，阳性细胞率为1.25 %;在CD34+CD38+和CD34+CD38-细胞的阳性表达均为1/3例，阳性细胞率分别是1.27 %和0 %(表2)。 可见，2B8a抗原在骨髓CD34+ 细胞上表达，在造血干/祖细胞亚群上主要在 CD34+CD38-原始干细胞上表达，在CD34+CD38+的造血祖细胞的表达则较低，而在G-CSF动员的PBSC 细胞上则不表达。Table 2. Reactivity of 2B8a antibody to CD34+ cells and its subsets derived from bone marrow and G-CSF mobilized peripheral blood hematopoietic stem/progenitor cells (略)

　　2B8a抗原在细胞系上的表达

　　共检测了6类细胞21个细胞系，2B8a抗体与B系细胞系Raji、SMS-SB、Nalm-6细胞呈强阳性反应，阳性细胞率分别为98.78 %、98.61 % 和94.93 %, 而与Nall-1细胞不起反应,阳性细胞率为5.68 %;2B8a除了与Molt-3弱阳性反应(31.40 %)外， 与其它T细胞系包括JM、CEM和Molt-4细胞均不起反应;在髓系细胞系中，2B8a在单核细胞系U937细胞表面的表达最高，阳性细胞率为67.78 %，而在其它髓系细胞系包括Meg-01、K562、KG1a、HEL和HL-60细胞上的表达则较低或不表达，阳性细胞率分别为33.40 %、29.70 %、28.19 %、16.23 %和802 %;2B8a在神经母细胞瘤细胞系包括SK-N-SH、KCNR、BE、LAN-1、SK-N-AS和结肠癌细胞系HR8348细胞上均不表达，但在羊膜细胞系FL细胞上有一定的表达,阳性细胞率为45.03 %(表3)。Table 3. Reactivity of 2B8a antibody to cell lines (略)

　　讨论

　　ZCH-2B8a是本研究采用原始髓细胞白血病细胞系KG1a作为免疫原通过杂交瘤技术研制成功的抗人白细胞分化抗原的单克隆抗体。该抗体经HLDA8协作组会议相关的研究机构全面地研究了解该抗体识别抗原的性质，提示该抗体所识别的分子可能是目前尚未认识的抗原[8]。因此，对该抗体在正常血细胞成分以及在各种血液肿瘤细胞系中的表达谱研究具有重要意义。采用流式细胞仪和一系列标准化荧光素直接标记的抗体对外周血、骨髓、G-CSF动员的外周血造血干/祖细胞进行设门定义分析，方法可靠[6,11]。结果显示，2B8a抗原主要在B细胞系与单核细胞系细胞上表达，在经检测的4个B细胞系中，虽然其中的3个呈现高表达，但在一个B细胞系即Nall-1细胞上却不表达，原因不明。另外，该抗体虽然用KG1a作为免疫原并用该细胞系进行筛选获得，但该抗体识别的抗原在KG1a细胞上的表达却很低，原因是克隆该抗体的时候，在同一培养孔中克隆出来的细胞培养上清中，亚克隆到2个反应强度不同的杂交瘤克隆，其中弱反应的1个(命名为ZCH-2B8a)被克隆建株保留下来进行了深入研究。 此外，该抗体在上皮性羊膜细胞系FL细胞上的表达也较高，这与HLDA8协作组研究结果一致。该研究机构总部信息提示，该抗体与宫颈癌细胞系HeLa细胞与鳞状上皮细胞系HUT.78有一定的反应性(HLDA8信息交流)，其原因不明。 根据HLDA8总部信息反馈得知，该抗体对骨髓瘤细胞系如JJN3、OPM1有很强的反应性(HLDA8信息交流)，对外周血B细胞、浆细胞无反应，提示该抗体可能可以用于骨髓瘤的诊断，本研究尚未采用骨髓瘤病人标本进行分析，这一方面有待于进一步深入研究。此外，HLDA8研究结果显示，该抗体对正常外周血成分包括淋巴细胞、粒细胞、单核细胞和骨髓细胞无反应，而对活化的B细胞及T细胞有反应，提示该抗体识别的抗原是一种活化分子，在免疫应答中发挥作用，究竟发挥何种免疫应答反应也有待于进一步深入研究。由于该抗体是最近研制成功的，其所识别抗原的许多生物学功能和特性尚未阐明，这些都有待于进一步深入研究。总之，ZCH-2B8a 主要与B细胞肿瘤包括白血病、淋巴瘤及骨髓瘤，单核巨噬细胞肿瘤细胞系U937和羊膜上皮细胞FL起反应，提示它可能有助于对这些疾病的诊断与治疗。

　　【参考文献】

　　1 Mason D. Leucocyte Typing VII. New York: Oxford University Press Inc, 2002; 747-931

　　2 Kraj M, Poglod R, Kopec-Szlezak J, et al. C-kit receptor (CD117) expression on plasma cells in monoclonal gammopathies. Leuk Lymphoma, 2004; 45: 2281-2289

　　3 Riccioni R, Rossini A, Calabro L, et al. Immunophenotypic features of acute myeloid leukemias over expressing the interleukin 3 receptor alpha chain. Leuk Lymphoma, 2004; 45: 1511-1517

　　4 McKenna RW, Asplund SL, Kroft SH, et al. Immunophenotypic analysis of hematogones (B-lymphocyte precursors) and neoplastic lymphoblasts by 4-color flow cytometry. Leuk Lymphoma, 2004; 45: 277-285

　　5 Weide R, Pandorf A, Heymanns J, et al. Bendamustine/Mitoxantrone/Rituximab (BMR): a very effective, well tolerated outpatient chemoimmunotherapy for relapsed and refractory CD20-positive indolent malignancies. Final results of a pilot study. Leuk Lymphoma, 2004; 45: 2445-2449

　　6 Dworzak MN, Froschl G, Printz D, et al. Prognostic significance and modalities of flow cytometric minimal residual disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood, 2002; 99: 1952-1958

　　7 Zola H. Human leukocyte differentiation antigens as therapeutic targets: the CD molecules and CD antibodies. Expert Opin Biol Ther, 2001; 1: 375-383

　　8 Horejsi V, Hovvath O, Angelisova P, et al. Non-lineage section samples-Cytofluorometry and Western Blotting. Abstracts and Program of 8th International Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens. Adelaide, South Australia, 2004; 85

　　9 汤永民, 郭淑芬, 沈红强. 一个识别与Leu-15不同表位的抗人CD-11b单克隆抗体4F8. 中华血液学杂志，2002;23：272-274

　　10 Upham JW, Lundahl J, Liang H, et al. Simplified quantitation of myeloid dendritic cells in peripheral blood using flow cytometry. Cytometry，2000; 40: 50-59

　　11 沈红强， 汤永民， 杨世隆等. 多色流式细胞术在222例儿童急性白血病免疫分型中的应用. 中华儿科杂志，2003; 41: 334-337.