rhG-CSF动员对供者T细胞增殖和细胞毒的影响

　　作者：黄文荣,王立生,高春记,鲁茁壮,王　　作者单位：

　　【摘要】为了解rhG-CSF动员对供者T细胞增殖和细胞毒的影响，在rhG-CSF动员前和动员后第5天抽取供者外周血分离单个核细胞(PBMNC)，在PBMNC中加入CD3单克隆抗体和rhIL-2以激活T细胞，培养96小时后检测T细胞增殖率和细胞毒性，并进一步对动员前后激活的T细胞用流式细胞术检测Fas表达率，用RT-PCR检测穿孔素(perforin)和Fas配体(FasL)mRNA表达情况,应用放射免疫分析方法检测细胞的γ干扰素(IFN-γ)分泌情况。结果发现， 供者外周血T细胞增殖能力在应用rhG-CSF后下降(68.5±15.1)%(P<0.05);动员后CD3单克隆抗体和rhIL-2激活后T细胞对K562细胞的细胞毒性均比动员前细胞有显著减弱(P<0.05);动员前后T细胞在激活后的Fas表达率无明显差异(P>0.10);动员前后T细胞在激活后均表达perforin mRNA，不表达FasL mRNA;动员前T细胞激活后分泌IFN-γ的能力明显高于动员后(P<0.01)。结论： rhG-CSF动员致使供者T细胞在CD3单克隆抗体与rhIL-2激活后的增殖率和细胞毒性下降。

　　【关键词】 rhG-CSF动员;T细胞增殖;细胞毒性

　　Impact of Mobilization with rhG-CSF on the Proliferation and Cytotoxicity of Donor's T Cells　HUANG Wen-Rong, WANG Li-Sheng, GAO Chun-Ji, LU Zhuo-Zhuang, WANG Hua, DUAN Hai-Feng, DA Wan-Ming　Department of Hematology, General Hospital of PLA, Beijing 100853,China; 1Institute of Radiation Medicine, Academy of Melitary Medical Sciences, Beijing 100850, China

　　AbstractThe study was to understand the impact on the proliferation and cytotoxicity of donor′ s T cells during mobilization with rhG-CSF. The peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) were collected from 15 donors before mobilization and on fifth day of mobilization with rhG-CSF. After the PBMNC were activated with 500 ng/ml of CD3 monoclonal antibody and 500 μg/ml of rhIL-2 for 96 hours, the activated T cells were collected for testing proliferation, cytotoxicity, Fas expression, perforin and Fas ligand (FasL) mRNA expression, the IFN-γ concentration in the culture medium of the activated T cells was determined by radioimmunoassay. The results showed that the proliferation activity of T lymphocytes and the cytotoxicity of T cells activated with CD3 monoclonal antibody and rhIL-2 were reduced markedly after mobilization with rhG-CSF(P<0.05). The Fas molecule expression in the activated T cells was very high both before and after mobilization with rhG-CSF(P>0.10). The activated T cells expressed perforin mRNA and didn′ t express FasL mRNA both before and after mobilization with rhG-CSF. The concentration of IFN-γ in the culture medium of the activated T cells decreased significantly after mobilization with rhG-CSF(P<0.01). It is concluded that activity of proliferation and cytotoxicity of donor's T cells is impaired after mobilization with rhG-CSF.

　　Key wordsrhG-CSF mobilization; T cell proliferation; cytotoxocity

　　重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)是异基因外周血造血干/祖细胞(PBPCs)动员最常用的细胞因子，使用rhG-CSF对供者进行动员以获得移植所需的造血干/祖细胞的过程中，供者外周血T细胞的数量和功能均因rhG-CSF的应用而发生了一系列改变[1]。因此，虽然异基因外周血造血干/祖细胞移植输入的T淋巴细胞比骨髓移植高10倍以上，但急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发生率和严重程度并未明显增加[2]。本研究旨在观察供者外周血T细胞在rhG-CSF动员前后增殖和细胞毒的变化及相关因素。

　　材料和方法

　　病例和动员方案

　　健康供者15例，男性8例，女性7例，中位年龄33(15-49)岁。动员方案为正常供者在全面查体完毕后给予rhG-CSF(Kirin公司产品)10 μg/(kg•d)进行动员，连续7天，动员前和动员后第5天取外周血10 ml分离外周血单个核细胞(PBMNC)，计数备用。

　　单个核细胞增殖能力的检测

　　在96孔平底培养板接种供者动员前后PBMNC 5×104/孔，刺激组加入CD3单克隆抗体(Neo Markers公司产品)500 ng/ml和rhIL-2(北京邦定公司产品)500 U/ml刺激T细胞增殖，对照组加入等体积生理盐水，培养终体积100 μl，每组均设3个复孔，培养基为含15% FCS 的RPMI 1640的完全培养液。在刺激培养前和培养96小时后以改良的MTT法检测细胞增殖情况[3]，在波长570 nm处测OD值。

　　细胞增殖率(%)=[(刺激组细胞OD值-对照组细胞OD值)/培养前细胞OD值]×100%。

　　单个核细胞的培养

　　将供者动员前后PBMNC按5×105/ml接种于培养瓶中，培养液为含15% FCS RPMI 1640的完全培养液，加入CD3单克隆抗体500 ng/ml和rhIL-2 500 U/ml激活T细胞培养96小时后收集悬浮细胞计数，取样进行细胞毒性检测、流式细胞术分析和RT-PCR测定;取细胞培养液进行细胞因子含量检测。

　　实验分组

　　实验分为CD3单克隆抗体刺激组和对照组。

　　细胞毒性检测

　　以激活培养的T细胞作为效应细胞，K-562细胞作为靶细胞，在96孔平底板中加入K562细胞2×104/孔，按效靶比20∶1、10∶1、5∶1加入效应细胞后将效应细胞与靶细胞混匀，终体积200 μl，培养6小时后行改良MTT法检测靶细胞被杀伤情况。

　　细胞毒(%)=[1-(效应细胞与靶细胞作用孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值]×100%。

　　Fas表达率的流式细胞术分析

　　将激活后T细胞取样以FITC-Ig G1作为同型对照、FITC-Fas作为标记抗体(Becton Dickinson公司产品)进行单色荧光直接标记，加入抗体后置4℃冰箱避光作用30分钟，标记结束后洗去多余抗体进行流式细胞术检测Fas表达率。

　　Perforin和FasL mRNA表达的RT-PCR检测

　　将激活后T细胞取样使用TRIzoL (Invitrogen公司产品)一步法提取细胞总RNA，取2 μg RNA逆转录合成cDNA第一链后行PCR扩增perforin和FasL片段。Perforin的上游引物5′-CTCATCGGCT ATCGTTAGTGC-3′，下游引物5′-GGTGGGAACAG CCTCTTGG-3′，扩增产物281 bp;FasL的上游引物5′-TTCCCTGTCCAACCTCTGTG-3′ ，下游引物5′-CAATCCTACCAAGGCAACCA-3′，扩增产物203 bp。内对照β-actin上游引物5′-GGGACCTGACTA ACTACCTC-3′，下游引物5′-CAGTGATCTCCTTCT GCATC-3′，扩增产物396 bp。PCR反应条件96℃预变性2分钟，94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环后72℃延伸10分钟取产物10 μl在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳分离检测。

　　细胞因子检测

　　使用IFN-γ放射免疫测定盒(解放军东亚研究所制品)检测细胞培养液中的IFN-γ含量，具体操作按说明书进行。

　　统计分析

　　配对资料的t检验。

　　结果

　　动员前后T细胞的增殖能力

　　rhG-CSF动员前后供者T细胞在CD3单克隆抗体+rhIL-2刺激下的增殖情况见图1。由图1可见供者外周血T淋巴细胞的增殖能力在应用rhG-CSF后下降(68.5±15.1)%(P<0.05)。

　　动员前后T细胞激活后的细胞毒性

　　rhG-CSF动员前后供者T细胞在CD3单克隆抗体加rhIL-2激活后对K562细胞的细胞毒性见附表，动员后激活的T细胞在效靶比为20∶1、10∶1、5∶1时的细胞毒性均比动员前细胞有显著减弱(P<0.05)。本试验还观察到激活培养后细胞对K562细胞的杀伤活性在一定程度上与效靶比呈剂量依赖关系，当效靶比低于20∶1时，效靶比越大，杀伤K562细胞活性越强(P<0.05)。Table. Cytotoxicity of activated T cells to K562 cells before and after mobilization with rhG-CSF(略)

　　动员前后T细胞激活后的Fas表达

　　rhG-CSF动员前后供者外周T细胞在CD3单克隆抗体加rhIL-2激活后Fas表达率为(94.5±5.9)%，动员后为(92.8±6.4)%，动员前后供者外周T细胞在激活后的Fas表达率无明显差异(P>0.10)。

　　动员前后激活T细胞的perforin和FasL mRNA表达

　　供者动员前、后外周血T细胞被CD3单克隆抗体+rhIL-2激活后均表达perforin mRNA，不表达Fas-L mRNA(图2、3)。

　　动员前后激活的T细胞的IFN-γ分泌能力

　　rhG-CSF动员前供者T细胞被CD3单克隆抗体+rhIL-2激活后的培养液中IFN-γ含量为19.4±7.1 U/ml，动员后T细胞激活后的培养液中IFN-γ含量为6.4±7.2 U/ml，动员前T细胞激活后的培养液中IFN-γ含量明显高于动员后(P<0.01)。

　　讨论

　　我们[4]曾报道，在使用rhG-CSF动员外周血造血干/祖细胞过程中供者外周血淋巴细胞绝对数值增加为动员前的1.5倍，但CD3+T淋巴细胞、CD4+/CD8+淋巴细胞比值在动员前后PBMNC中所占的相对比例并无明显变化。本研究进一步证实rhG-CSF动员引起T细胞增殖能力明显下降，这与国外研究报道一致[1]。由于至今仍未证实T细胞表面有G-CSF受体表达，推测rhG-CSF动员抑制T细胞增殖可能与rhG-CSF对单核细胞及树突状细胞的作用有关。rhG-CSF动员使单个核细胞增加，约为动员前的7.5倍[1]，且动员后单核细胞在受到刺激时IL-10分泌显著增加[5]。IL-10不仅可以直接抑制T细胞对异体抗原或有丝分裂原刺激产生的增殖反应[6]，还可以通过DC细胞间接抑制T细胞的增殖反应，即IL-10可作用于DC细胞后通过下调DC细胞B7共刺激分子、MHC-II、IL-12、TNF-α、IL-6和IL-1β等分子的表达而抑制DC细胞与T细胞间的反应，致使T细胞不能对异体抗原和抗原肽产生有效的增殖反应[7]。IL-10的分泌与单核细胞数量显著相关[5]，国内陈鹤松等[8]报道，适度减少动员PBMNC中单核细胞数量后，动员后淋巴细胞在植物血凝素刺激下的增殖反应显著增加。rhG-CSF动员不仅使T细胞增殖能力明显下降，还使T细胞活化后的细胞毒性明显减弱，效靶比在20∶1、10∶1、5∶1时的细胞毒动员后均比动员前显著下降。T细胞活化后的细胞毒主要与穿孔素(perforin)、颗粒酶及细胞因子的分泌有关[9]。穿孔素贮存于电子稠密的胞浆颗粒中，在杀伤相时穿孔素从颗粒中释放，并在Ca2+存在下插入靶细胞膜上，多聚化后形成管状的多聚穿孔素管道，这种异常通道使Na+、水分进入靶细胞内，K+及大分子物质从靶细胞内流出，改变细胞渗透压而导致靶细胞溶解。本研究证实动员前后T细胞在激活后均表达穿孔素mRNA，这与动员前后激活的T细胞均能杀伤靶细胞有关。Fas/FasL间的作用在T细胞的活化诱导性细胞死亡方面具有重要作用，部分活化的T细胞同时表达Fas和FasL，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起相应T细胞死亡[10]。本研究中动员前后T细胞在激活后均高表达Fas分子，可能与T细胞在活化过程中Fas表达被诱导增加有关[11];但动员前后激活的T细胞经反复多次检测均未能检出FasL mRNA的表达，这可能与T细胞激活的时间有关。本研究中激活培养96小时的T细胞不表达FasL mRNA，这避免了FasL作用于Fas造成该阶段激活的T细胞由于自身攻击而发生凋亡。进一步的细胞因子检测发现，动员前T细胞激活后的培养液中IFN-γ含量明显高于动员后，这提示rhG-CSF动员后T细胞在使用CD3单克隆抗体+rhIL-2激活后IFN-γ分泌能力比动员前明显下降，而IFN-γ能与穿孔素协同作用以增加细胞毒性[12]，这可能与动员后T细胞在激活后的细胞毒性明显比动员前激活的T细胞减弱有关。rhG-CSF不仅在动员过程中会引起的移植物中T细胞等免疫细胞数量与功能变化，移植后给予rhG-CSF促进造血重建过程也会对免疫细胞功能产生负调节作用，一方面可以降低HLA不相合异基因造血干/祖细胞移植后的移植物排斥和移植物抗宿主病发生率，另一方面会使免疫重建延迟而增加移植后的感染率[13]。rhG-CSF的应用是否会影响移植物抗肿瘤效应还需要深入研究，目前有关rhG-CSF对免疫系统的负调节机理还存在许多争议，rhG-CSF的应用的利弊及条件还需要进行大量严谨的临床研究来判断。

　　致谢：感谢我院生化教研室为相关标本进行细胞因子含量的放免测定。

　　【参考文献】

　　1 黄文荣,达万明. rhG-CSF在外周血造血干细胞动员过程中对T细胞的影响及机制.中国实验血液学杂志,2005; 13:338-342

　　2 达万明,黄文荣.异基因外周血造血干/祖细胞移植的进展.临床血液学杂志,2003;16:144-147

　　3 黄文荣,高春记,张伯龙等.多种细胞因子激活骨髓免疫细胞及细胞毒的研究.中国实验血液学杂志,2001;9:48-50

　　4 黄文荣,达万明,邓新立等.中剂量rhG-CSF动员对供者外周血免疫细胞组成的影响.中国实验血液学杂志, 2005; 13: 852-856

　　5 Saito M, Kiyokawa N, Taguchi T, et al. Granulocyte colony-stimulating factor directly affects human monocytes and modulates cytokine secretion. Exp Hematol, 2002; 30:1115-1123

　　6 Zeller JC, Panoskaltsis-Mortari A, Murphy WJ, et al. Induction of CD4+ T cell alloantigen-specific hyporesponsiveness by IL-10 and TGF-beta. J Immunol, 1999; 163:3684-3691

　　7 Steinbrink K, Graulich E, Kubsch S, et al. CD4+ and CD8+ anergic T cells induced by interleukin-10-treated human dendritic cells display antigen-specific suppressor activity. Blood, 2002; 99:2468-2476

　　8 陈鹤松,黄晓军.rhG-CSF动员正常人外周血干细胞过程中对T淋巴细胞增殖的影响.中华血液学杂志, 2003;24:420-422

　　9 Lowin B, Peitsch MC, Tschopp J. Perforin and granzymes: crucial effector molecules in cytolytic T lymphocyte and natural killer cell-mediated cytotoxicity. Curr Top Microbiol Immunol, 1995;198:1-24

　　10 Zhang J, Gao JX, Salojin K, et al. Regulation of fas ligand expression during activation-induced cell death in T cells by p38 mitogen-activated protein kinase and c-Jun NH2-terminal kinase. J Exp Med, 2000;191:1017-1030

　　11 Li XR, Chong AS, Wu J, et al. Transcriptional regulation of Fas gene expression by GA-binding protein and AP-1 in T cell antigen receptor.CD3 complex-stimulated T cells. J Biol Chem, 1999; 274:35203-35210

　　12 Badovinac VP, Tvinnereim AR, Harty JT. Regulation of antigen-specific CD8+ T cell homeostasis by perforin and interferon-gamma. Science, 2000; 290:1354-1358

　　13 Volpi I, Perruccio K, Tosti A, et al. Postgrafting administration of granulocyte colony-stimulating factor impairs functional immune recovery in recipients of human leukocyte antigen haplotype-mismatched hematopoietic transplants. Blood, 2001; 97: 2514-2521.