α-1，3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶等位基因467C>T和539G>C变异导致A2亚型

　　作者：许先国,洪小珍,吴俊杰,马开荣,傅启华　　作者单位：浙江省血液中心输血研究所，卫生部血液安全研究重点实验室，杭州

　　【摘要】为了研究中国汉族人群ABO血型系统中A2亚型的分子遗传背景，发现并鉴定新的ABO等位基因，采用血型血清学方法鉴定5例ABO血型疑难样本，PCR扩增ABO基因转录调控序列和全编码序列，PCR产物经割胶纯化后直接测序，并对含有变异位点的扩增片段进行单倍体序列分析。结果表明： 5例疑难样本分别鉴定为A2或A2B亚型;进一步研究发现，1例A2B和1例A2样本分别含有A201和A205等位基因，另3例A2B样本中发现一个新的A2等位基因。该等位基因与A101相比，差异在外显子7的467C>T和539G>C变异，导致多肽链P156L和R180P的替换。结论：首次发现467C>T和539G>C组合的A2等位基因，中国汉族人群中A2亚型具有遗传多态性。

　　【关键词】 A2亚型;α-1，3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶;ABO血型系统

　　Variants 467C>T and 539G>C of the α-1，3-N-acetylgalactosaminyltransferase Allele Responsible for A2 SubgroupXU Xian-Guo，HONG Xiao-Zhen，WU Jun-Jie，MA Kai-Rong，FU Qi-Hua，YAN Li-Xing　Institute of Transfusion Medicine，Blood Center of Zhejiang Province; Key Laboratory of Blood Safety Research，Ministry of Health. Hangzhou，310006 China

　　Abstract The purpose of this study was to investigate the molecular genetic basis of A2 subgroup and identify the novel alleles at ABO locus in Chinese Han population. All seven exons and their flanking sequences，enhancer and promoter in the ABO gene of five samples from individuals with serological discrepancies were amplified by polymerase chain reaction (PCR); the PCR products were screened by directly sequencing; the haplotypes of exon 6 and 7 were analyzed by TOPO cloning sequencing. The results showed that five samples were identified as A2 or A2B subgroup by serological technology. The A201 and A205 alleles were confirmed in one A2B individual and one A2 individual，respectively. A novel A2 variant allele was identified in three A2B individuals. The two nucleotide acid alterations (467C>T and 539G>C) at the exon 7 resulting in two amino acid substitutions (P156L and R180P) in this novel allele were observed，when compared with A101 allele. It is concluded that the polymorphism of A2 allele is found to be relatively variable in Chinese population，and a novel A208 allele responsible for A2 subgroup is firstly reported.

　　Key words A2 subgroup; α-1，3-N-acetylgalactosaminyltransferase; ABO blood group system

　　ABO血型系统是具有重要临床意义的人类红细胞血型系统，涉及临床安全输血、器官移植和法医学鉴定等领域。分子克隆研究显示，ABO基因位点包括3个主要等位基因A101(或α-1，3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶等位基因)、B101(或α1，3半乳糖基转移酶等位基因)和O01。A101和B101等位基因含7个外显子，转录的mRNA全长1 065 bp，编码1条354个氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质具有糖基转移酶活性，能将相应的糖基连接到FUT1基因相关的前体物质H上，形成A或B抗原。A101和B101仅有7个核苷酸的差异，形成4个氨基酸的替换，其中235、266和268位氨基酸对酶的特异性具有决定性作用。而O等位基因由于cDNA第261位单核苷酸G缺失引起移码突变，形成一条无糖基转移酶活性的多肽链。除3个主要等位基因外，陆续在不同人种及个体中发现许多与各种ABO亚型相关的等位基因。我们在对中国人群的Ael、cisAB和Bw等亚型研究中，发现了中国人群部分ABO亚型的分子遗传背景[1，2]。A2亚型在白人和黑人中频率较高，但在东方人群中较为罕见，目前国际上共发现7个A2等位基因，但在这方面国内研究甚少。为了解中国大陆A2亚型的遗传背景，我们对5例含有A2抗原的汉族志愿捐血者进行ABO基因转录调控序列及全编码序列分析，检测到2个已报道的和1个新的A2等位基因。

　　材料和方法

　　样本

　　5例血清学A2亚型样本(3例男性，2例女性，汉族，均无血缘关系)，无偿献血时发现ABO血型正反定型不符而深入研究。以15例随机无血缘关系样本为对照。所有样本均经捐血者知情同意。

　　方法

　　血清学试剂和方法

　　血型正反定型按本实验室方法[2]，试剂包括单克隆抗-A、抗-B(长春博德公司产品)，抗-A1 Lectin和抗-H(Titus公司产品，加拿大)，抗-A，B(Immucor公司产品，美国)，自制反定型红细胞。

　　样本DNA提取

　　采用QIAamp blood kit(Qiagen公司产品，德国)提取基因组DNA。

　　ABO基因扩增

　　增强子、启动子和外显子1-5基因片段的扩增参照本实验室建立的方法 [1]。另外以Premier 3软件设计引物对E67-F(5’-CTCAAGGGGCTGTTCTGAAG-3’)和E67-R(5’-GCGATTGCGTGTCTGTGTAT-3’)扩增内含子5’到3’-UTR基因片段(包含外显子6和7、内含子6及部分内含子5和3’-UTR序列，产物长2 749 bp)。扩增反应体系总体积100 μl，其中含10×PCR buffer 10 μl，样本DNA 5 μl(约200-400 ng)，LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司产品，大连) 3.0 U; dNTP、MgCl2终浓度分别为0.2 mmol/L、1.7 mmol/L，引物终浓度为0.5 μmol/L。扩增条件为94℃预变性3分钟，94℃ 30秒，62℃ 30秒，72℃ 3分钟，30个循环。扩增产物以QIAquick Gel Extraction kit割胶纯化(Qiagen公司产品，德国)。

　　PCR产物直接序列分析

　　参照本实验室建立的方法[3]，以BigDye terminator V3.0 kit(ABI公司产品，美国)试剂进行序列分析，其中外显子6和7测序引物为E6R(5’-GCCACCCCACTCTGTCTT-3’)、I6F(5’-CCGTCCGCCTGCCTTGCAG-3’)、792R(5’-GTAGA-AATCGCCCTCGTCCT-3’)和628F(5’-GTGGACGTGGACATGGAGTT-3’)，其它测序引物为PCR扩增引物。

　　单倍体序列分析

　　采用TOPO TA Clonging kit(Invitrogen公司产品，美国)对5个A2样本的外显子6和7扩增片段进行TA克隆，挑取多个阳性菌落进行测序鉴定。

　　结 果

　　血清学检查结果

　　血型正反定型结果见表1。5个样本均含有A2抗原，其中样本2为A2表型，其余4个样本为A2B表型。Table 1. Results of blood group serological detection(略)

　　PCR产物直接序列分析

　　15例正常对照样本测序结果分别与A101(GenBank AC000397)、B101或O01等位基因序列一致，并与其血型血清学结果符合。5例A2B或A2亚型的增强子、启动子以及外显子1-5与A101序列完全一致;内含子5到3’-UTR序列见表2：其中样本1除外显子7的467C/T和1061del/C杂合外，其余位点符合A101B101杂合特征;样本2除外显子7的467C/T和1009A/G杂合外，其余位点符合A101O01特征;样本3、4和5除外显子7的467C/T和539G/C杂合外，其余位点符合A101B101特征。各样本的变异位点均经过多次PCR扩增和测序证实，排除因PCR扩增引入的假变异。Table 2. A partial sequence of intron 5 to 3’-UTR in ABO gene locus(略)

　　单倍体序列分析

　　在多个克隆中，样本1检测到A201(467C>T，1061delC)和B101等位基因;样本2检测到A205(467C>T，1009A>G)和O01等位基因;样本3、4和5其中一单倍体为B101，另一单倍体除467C>T和539G>C变异外，其余序列与A101一致(附图)。经检索，未发现此变异组合的ABO等位基因，目前该等位基因已被血型抗原基因突变数据库(Blood Group Antigen Gene Mutation Database，BGMUT)确认并命名为A208等位基因(http://www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/systems_alleles.php?system=abo)。

　　讨论

　　自1992年Yamamoto等报道了第一个A2等位基因以后，迄今在不同地区和人群中发现了7个A2等位基因，分别为A201(467C>T，1061delC)[4]、A202(1054C>T)、A203(1054C>G)、A204(B-O1v杂交等位基因)[5]、A205(467C>T，1009A>G)[6]、A206(1061delC)[7]和A207(539G>C)[8]，中国大陆仅喻琼等[9]报道过A201和A205等位基因。本实验证实在中国汉族人群中存在A201和A205等位基因，实验还发现了另一个A2等位基因(467C>T，539G>C)。检索显示，467C>T变异在各类ABO亚型中频率相对较高，根据BGMUT数据，截止到2005年7月，在139个ABO等位基因中，至少有21个等位基因含有467C>T变异，而539G>C仅发现于最新报道的A207等位基因，并经人群频率研究证实为ABO基因新突变位点[8]。但未发现同时包含467C>T和539G>C的等位基因，表明该等位基因是一个新的ABO等位基因组合，是迄今发现的第8个A2等位基因。467C>T和539G>C分别导致多肽链Pro156Leu和Arg180Pro的替换，考虑到单独的539G>C突变(即A207等位基因)即能引起A2亚型，推测Arg180Pro而非Pro156Leu是引起α-1，3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶活性改变进而形成A2亚型的主要原因，这类似于A201(467C>T，1061delC)和A206(1061delC)的关系。A208等位基因的发现从另一侧面证实了A207等位基因存在的真实性，虽然后者迄今仅发现2个先证者[8]。

　　在已发现的A2等位基因中，引起酶活性改变的核苷酸突变大多位于外显子7的3’ 端(编码多肽链的C端)，如A201和A206的1061delC、A202的1054C>T、A203的1054C>G和A205的1009A>G，所以一直以来对A2亚型的理解是多肽链C端的氨基酸变异导致糖基转移酶活性改变，而最近发现的A207和本实验的A208等位基因的变异点均靠近外显子7的5’端，Pro156Leu和Arg180Pro替换在多肽链的空间结构上远离由关键氨基酸235Gly、266Leu和268Gly组成的酶活性中心，这提示对A2亚型的遗传背景不应局限在原来的理论上。

　　值得注意的是，另2个ABO等位基因A304和Bw05在539G位点也发现核苷酸变异，不同的是A304和Bw05等位基因为539G>A转换[10，11]，而本实验的A208等位基因为539G>C颠换，二者可能是在不同等位基因基础上发生的相互独立的核苷酸突变，但恰好发生在同一位点。类似的巧合也发现于ABO基因其它位点，如Aw06(502C>G)[12]和Bel03(502C>T)[13]，cisAB03(700C>T)[14]和B(A)02(700C>G)[15]等。

　　本实验在5例无关A2亚型样本中发现3种不同A2等位基因，表明中国汉族人群中A2亚型可能存在遗传多态性。在中国人群中是否还存在其它A2等位基因，哪种等位基因为A2亚型的主要等位基因形式等等，尚待较大样本证实。

　　【参考文献】

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