Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究

　　作者：陈丽娟,李建勇,钱思轩,朱广荣　　作者单位：南京医科大学第一附属医院、江苏省人民医院血液科，南京

　　【摘要】为了研究velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡效应及机制，采用台盼蓝拒染法检测2、10、50和100 nmol/L velcade处理U266细胞活率，用流式细胞术分析Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基(ROS)，用半定量RT-PCR法检测bcl-2 mRNA的表达。结果表明：velcade抑制U266细胞增殖;诱导U266细胞凋亡，24小时Annexin-V阳性细胞比例增高，△ψM降低;12小时时活性氧明显增高，荧光强度增强; 抗凋亡基因bcl-2表达降低。结论：velcade对U266细胞具有增殖抑制和杀伤作用，其可通过内源性细胞凋亡信号通路诱导U266细胞凋亡。

　　【关键词】 velcade; 多发性骨髓瘤; 细胞凋亡

　　Multiple Myeloma Cell Line U266 Apoptosis Induced by VelcadeCHEN Li-Juan，LI Jian-Yong，QIAN Si-Xuan，ZHU Guang-Rong，ZHENG Wen-Juan　　Department of Hematology，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Jiangsu Province People Hospital，Nanjing 210029，China

　　Abstract To investigate the effect of velcade on multiple myeloma cell line U266 apoptosis and its mechanism，cell viability was estimated by trypan blue dye exclusion. Annexin-V，mitochondrial transmembrane potential (Δψm) and reactive oxygen species (ROS) labeled by DCFHDA were examined by flow cytometry，the expression of bcl-2 mRNA was detected by semi-quatitative RT-PCR. The results showed that the velcade inhibited the growth of U266 cells and reduced cell viability accompanied by appearance of morphologic characteristics of apoptosis. Velcade at 50 nmol/L increased Annexin V positivity and fluorescence intensity of DCF because of ROS generation while it decreased the Δψm of U266 cells. Expression of anti-apoptotic gene bcl-2 mRNA also decreased. It is concluded that velcade inhibite the growth and reduce cell viability of U266 cells. Velcade can induce U266 cells apoptosis by intrinsic cell apoptotic pathway.

　　Key words velcade; multiple myeloma; apoptosis

　　多发性骨髓瘤(MM)是一种浆细胞克隆性增生的血液系统恶性肿瘤，多发生于老年人。随着社会人口的老龄化，其发病率呈逐渐增高的趋势。几十年来对MM一直采用激素和细胞毒性药物联合治疗，尽管近年来加用反应停抑制血管新生治疗或采用自体骨髓移植治疗，但其仍是一种不可治愈的血液系统肿瘤。由此可见，开发新的治疗方法有重要的临床价值。蛋白酶体抑制剂近年来作为MM新的治疗制剂用于临床试验，本研究就临床新药蛋白酶体抑制剂velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞的凋亡作用进行探讨。

　　材料和方法

　　细胞培养

　　U266细胞置于含10%的热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液(Gibco公司产品) 中，于37℃、5% CO2和95%空气湿度条件下进行培养。实验过程中，细胞以(2-5)×105 细胞/毫升的密度接种培养，并与不同浓度velcade一起进行孵育，对照加DMSO。细胞活率由台盼蓝拒染法检测，根据处理组存活细胞数与死细胞数的比例来计算。形态学观察，细胞用cytospin (Shandon，Runcorn，UK)收集至载玻片，用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。每次试验重复3次。生长抑制率及细胞活率按如下公式计算：

　　生长抑制率 =[(对照组细胞数-处理组细胞数)/对照组细胞数]×100%　存活率=[活细胞数/(活细胞数+死细胞数)]×100%

　　Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基(ROS)的流式细胞仪分析

　　Annexin-V 分析

　　使用FITC标记的Annexin V和PI双染法检测细胞凋亡，根据 Becton Dickinson Biosciences 公司提供的说明书进行操作。简单地说，取(1-2)×105 细胞，经PBS 漂洗后加100 μl 结合缓冲液，重悬细胞，加5 μl AnnexinV-FITC，10μl PI 避光孵育15 分钟后加400 μl 结合缓冲液，用流式细胞仪检测。

　　线粒体跨膜电位(Δψm)检测

　　取5×105细胞，用PBS清洗1次，加入10 μg/ml Rh123(Sigma公司产品)37℃孵育30分钟，用PBS漂洗1次，加入终浓度10 μg/ml PI 4℃暗处放置30分钟，用流式细胞仪检测。

　　活性氧测定 细胞内活性氧测定方法参照文献[1]方法进行，DCFHDA (Sigma公司产品)自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF 荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。DCF 的激发波长为485 nm，吸收波长为530 nm。将药物处理的细胞(1×105)经过PBS洗涤，重悬于1 ml含有10 μmol/L DCFHDA的PBS中，以未加染料的样品作为对照，37℃孵育20分钟，以PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测5 000个活细胞的荧光强度。

　　velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266 bcl-2 mRNA表达的半定量RT-PCR检测

　　细胞总RNA抽提 收集3×106细胞，用TRIzoL试剂(Gibco BRL产品)按说明书抽提细胞总RNA。

　　cDNA 合成及PCR 扩增 方法参见文献[ 2 ]，PCR引物：GAPDH：有义链5′-GAAGGTGAAGGT CGGAGTCA-3′;反义链5′-GAAGATGGTGATGG GATTTC-3′。bcl-2: 有义链5 ′-ACTTGTGGCCCA GATAGG-3′，反义链为5′-CGACTTCGCCGAGAT GTC-3′。PCR 产物用6 %聚丙烯酰胺凝胶电泳分析照相，在双波长色谱扫描仪上扫描电泳带。GAPDH片段长度216 bp，bcl-2片段389 bp。

　　结 果

　　velcade对U266细胞增殖抑制和杀伤作用

　　研究结果表明，velcade可以抑制U266细胞的生长，同时伴有细胞活率的降低。U266细胞经2、10、50和100 nmol/L浓度velcade 24小时处理后生长抑制率的3次均值分别为18.7%、45.45%、59.86%和68.9%，48小时时分别为34.45%、61.46%、73.75%和82.04%;在0、2、10、50和100 nmol/L浓度时24小时活率分别为97.31%、91.38%、79.91%、61.48%和42.62%，48小时时分别为96.57%、76.60%、58.41%、30.40%和14.05%。根据活率48小时时下降70%-80%选择药物浓度，因此选择velcade 50 nmol/L作为药物处理浓度(图1)。

　　velcade对U266细胞凋亡作用

　　50 nmol/L velcade处理的U266细胞呈现出细胞形态学改变，表现为染色体凝聚、细胞核破裂而细胞膜保持完整及出现多个凋亡小体等(图2A)。24小时Annexin V-FITC/PI 双标结果显示，凋亡细胞比例重复3次的均值为61.3%，明显高于未用velcade处理对照组的3.56%(图2B)。线粒体跨膜电位(△ψM)检测显示△ψM降低，Rh123阳性细胞比率重复3次的均值为56.3%，对照为95.02%(图2C)。

　　活性氧检测

　　我们采用DCFHDA检测velcade处理的U266细胞活性氧及平均荧光强度。结果发现，在12小时时活性氧明显增高，平均荧光强度显著增高，由对照的1.95增强到10.8，流式细胞仪直方图右移(图3)。

　　bcl-2检测

　　采用RT-PCR检测内源性细胞凋亡通路最主要的基因bcl-2。结果显示，U266细胞经50 nmol/L velcade处理后，随着作用时间的延长，其表达逐渐降低(图4)。

　　讨 论

　　泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway，UP通路)是由泛素化系统和蛋白酶体组成，在调节细胞周期和肿瘤生长中有着重要的作用，该通路参与细胞内绝大多数的蛋白降解，如许多重要的涉及细胞信号转导、转录调控和细胞周期的调节蛋白。蛋白酶体存在于所有的真核细胞中，蛋白酶体抑制剂可以通过干涉这些重要蛋白的降解，触发肿瘤细胞周期阻滞，诱导肿瘤细胞凋亡而使肿瘤进展延缓或静止[3-7]。

　　Velcade 是一种硼酸二肽化合物，是高选择性、可逆性的26S蛋白酶体抑制剂，首先在美国国家肿瘤协会的一组60种肿瘤细胞系中表现出抗肿瘤作用。velcade对MM细胞的作用表现在诱导细胞凋亡、抑制生长、抑制细胞黏附和骨髓血管生成等多个方面。本研究显示，其对U266细胞具有增殖抑制作用，并随着时间的延长和剂量的增加呈现增殖抑制加强，活率降低趋势。

　　诱导细胞凋亡有3种信号通路：FAS信号通路、线粒体信号通路和内质网信号通路，目前认为线粒体途径在凋亡过程发挥枢纽作用。细胞凋亡过程中，细胞膜双分子层中的磷脂不平衡分布会被破坏，发生磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)由内层向外层的翻转，暴露在外面的磷脂酰丝氨酸可被周围的吞噬细胞识别、吞噬，从而使凋亡细胞得以被清除。

　　Annexin V 为一种磷脂结合蛋白，可特异性地识别细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸，所以经常被用于检测细胞凋亡[8]。Rh123 是一种亲脂性阳离子，可发射绿色荧光，它可被线粒体吸收，并且其吸收量与线粒体△ψm成正比[9]。正常的活细胞因为线粒体△ψm高，所以其摄入的Rh123 也高，因此细胞会发出绿色荧光。而细胞发生凋亡时线粒体△ψm会降低，细胞表现为Rh123 低染。本研究结果显示，Velcade处理U266细胞24小时时凋亡细胞明显增高，△ψm明显降低，这说明细胞大部分是通过诱导细胞凋亡而死亡的，Velcade还可通过线粒体信号通路，即内源性凋亡途径诱导U266细胞凋亡。

　　ROS 是细胞有氧呼吸过程中产生的一些小分子物质，主要包括O-2 、OH-及其活性衍生物如H2O2 、HOCl 、O2等。这些物质具有较高的反应活性，易与细胞内的大分子物质反应，导致细胞结构的广泛损伤，如膜脂质过氧化、蛋白质及核酸等的氧化损伤等。近年的研究认为，活性氧是细胞凋亡的信号之一，ROS的产生可直接或间接改变线粒体膜电位，促进Cyt C从线粒体内释放，启动线粒体信号通路，诱导细胞凋亡[10]。线粒体是ROS产生的主要场所，内质网(ER)中同样会有ROS的生成。Fribley 等报道[11]蛋白酶体抑制剂velcade通过同时诱导ER应激(stress)和ROS生成引起人头颈癌细胞凋亡，ROS的抑制剂Tiron能够显著抑制凋亡，caspase-9和caspase-3的活化，并且能够阻碍ER应激相关蛋白ATF-4和CHOP/GADD153的表达。这些结果提示，ROS在ER 应激诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。用DCFHDA 作为荧光探针测定细胞内ROS 水平时，发现velcade在24小时时能明显增高U266细胞内活性氧水平，这说明velcade可改变多发性骨髓瘤细胞内氧化还原状态，导致线粒体和内质网产生ROS增多，从而诱导U266细胞凋亡。由此我们推测，不仅线粒体途径参与了velcade诱导的多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡，而且ER应激途径也可能通过ROS的产生而发挥诱导凋亡作用。

　　bcl-2基因是抗细胞凋亡的关键基因，其表达的增高与多种肿瘤有着密切关系，并且可导致肿瘤细胞抵抗糖皮质激素、柔红霉素、阿糖胞苷及VP16等化疗药物诱导的凋亡，使肿瘤细胞对各种化疗药物耐受，导致缓解率低[12]。bcl-2表达降低在内源性细胞凋亡即线粒体信号通路中起关键作用，很多化疗药物可通过抑制bcl-2基因表达从而诱导肿瘤细胞凋亡。本研究通过半定量RT-PCR的方法检测了bcl-2 mRNA的表达，结果显示其表达水平降低，并随着velcade药物作用时间的延长而表达量逐渐减少，这一结果从分子水平进一步证实了velcade的诱导细胞凋亡作用及其作用机制主要是通过线粒体信号通路。

　　【参考文献】

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　　11 Fribley A，Zeng Q，Wang CY. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Mol Cell Biol，2004; 24: 9695-9704

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