动员人外周血巨核祖细胞体外扩增的研究

　　作者：夏婷,方建培,吴燕峰,徐宏贵,魏菁　　作者单位：广州市妇婴医院儿科，广州，510180;1中山大学附二医院儿科，广州，510120;基金项目：广东省卫生厅科研基金资助课题，编号A2003195

　　【摘要】本研究探讨多种细胞因子(TPO、SCF、FL、IL-1、IL-3、IL-6)组合的几种培养体系对人外周血CD34+细胞体外诱导扩增生成巨核细胞的作用，研究人外周血来源的巨核细胞体外扩增的最佳细胞因子组合及培养时间。用Ficoll-Hapaque分离法分离动员的外周血(MPB)单个核细胞，免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞，并将其在含胎牛血清的液体培养体系中、各组细胞因子诱导下培养15天。在不同时间点采用血细胞计数板进行细胞计数，采用流式细胞术检测培养体系中CD41+细胞的含量;同时采用甲基纤维素半固体培养法进行巨核细胞集落培养，测定巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)的数量。结果表明：经过15天的培养，在MPB来源的CD34+细胞体外诱导并扩增巨核祖细胞体系中，以TPO/FL/IL-6/IL-3组合的扩增效果最好，明显高于其它3组，CD41+细胞第5天、10天分别扩增了93.97±17.27倍、131.23±18.26倍。第15天CD41+细胞含量及CD41+细胞数迅速下降。CFU-MK产率(/1×103个细胞)第5天、10天分别为83.33±10.02个、120.67±13.01个，明显高于其余3组。结论：以TPO/FL/IL-6/IL-3因子组合为体外诱导扩增巨核祖细胞的最佳组合，动员外周血的巨核祖细胞体外诱导扩增以培养第10天为宜。本实验建立了动员人外周血来源的巨核祖细胞体外扩增体系。

　　【关键词】 动员人外周血; 巨核祖细胞; 体外扩增;

　　Ex vivo Expansion of Megakaryocytic Progenitors from Mobilized Human Peripheral Blood　XIA Ting，FANG Jian-Pei，WU Yan-Feng，XU Hong-Gui，WEI Qing　Department of Pediatrics，Guangzhou Maternal and Neonatal Hospital，Guangzhou 510180，China; 1Department of Pediatrics，The Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China

　　Abstract This study was aimed to investigate the effect of some culture system compased of various cytokine combinations (TPO，SCF，FL，IL-1，IL-3，IL-6) on ex vivo expansion of megakaryocytic progenitors inducced from CD34+ cells of peripheral blood and to seek a optimal cytokine combination and culture time. Mononuclear cells were isolated from mobilized peripheral blood (MPB) by density gradient centrifugation over Ficoll. CD34+ cells were purified by using an immunomagnetic bead separation system. The selected CD34+ cells were seeded in Iscove′ s modified Kulbecco′ s medium (IMDM) supplemented with fetal calf serum (FCS) and various kinds of cytokines. After 15 days of culture，the content of CD41+ cells in culture system were determined by flow cytometry，and the number of megakaryocyte colony-forming unit (CFU-MK) was measured simultaneously. The results showed that after definited days of culture，the cytokine combination TPO/FL/IL-6/IL-3 was the most suitable for MPB to obtain high number of MK，and better than any other three groups(P<0.05). The increase multiple of CD41+ cells was 93.97±17.27 on day 5 and 131.23±18.26 on day 10. On day 15，the proportion and the increase multiple of CD41+ cells decreased obviously. The expansion multiples of CFU-MK were 93.33±10.02 on day 5 and 120.67±13.01 on day 10，higher than any other groups. It is concluded that TPO/FL/IL-6/IL-3 combination was the best optimal for expansion ex vivo of megakaryocytic progenitors from MPB，and its suitable duration of culture was 10 days; a culture system for expansion ex vivo of megakaryocytic progenitors have been established in this study.

　　Key words　mobilized peripheral blood; megakargocyte; ex vivo expansion

　　造血干细胞移植或大剂量放、化疗后引起血小板减少，发生血小板缺乏症，严重时导致内脏出血、颅内出血，这是临床上肿瘤治疗中极需解决的问题。血小板的输入不仅有可能发生过敏反应和感染一些传染性疾病(肝炎及其它病毒感染);而且反复多次的血小板输注会给患者家庭带来一定的经济负担和诱发血小板抗体的产生，导致血小板输注无效。输入体外扩增的富含巨核细胞的产品，能增加体内形成血小板的能力，以缩短血小板缺乏期。因此，巨核祖细胞的体外诱导扩增并回输就成为解决这一问题的有效途径之一[1]。动员后的外周血(mobilized peripheral blood，MPB)造血干/祖细胞(CD34+细胞)含量比单份脐血(CB)和骨髓(BM)中的高，来源丰富，且具有较强的造血重建能力。近10年来，随着细胞因子的分离纯化和克隆，人们已对巨核细胞体外扩增进行了深入研究，以待早日广泛应用于临床。本实验就外周血来源的CD34+细胞在体外定向诱导扩增巨核祖细胞的最佳体系进行研究。

　　材料和方法

　　标本来源

　　MPB来自南方医院血液内科及本科移植中心，用1 ml一次性无菌注射器收集MPB 0.4-0.6 ml，共收集5份标本。

　　主要材料

　　人重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF，吉粒芬300微克/支，购自杭州九源基因工程有限公司)。TPO、IL-1β、IL-3、FL、FITC标记的抗人CD41a、CD34抗体(美国Peprotech 公司产品)，IL-6、SCF(麒麟鲲鹏生物药业公司产品);CD34+细胞分离试剂盒(德国Miltenyi Biotec公司产品);淋巴细胞分离液 (比重：1.077 g/ml，购自达科为生物技术公司)、小牛血清白蛋白(BSA，购自上海生物工程有限公司);IMDM、DPBS(美国Hyclone公司产品);胎牛血清(购自杭州四季青公司)。

　　外周血CD34+细胞的动员和分离富集

　　给供者或患者皮下注射rhG-CSF 5-10 μg/(kg•d)连续7天。用PBS1将MPB调成细胞悬液，加于淋巴细胞分离液(比重：1.077 g/ml)中。离心后，吸取中间白膜状单个核细胞层，用PBS1洗2次，再用PBS2洗涤1次。测定细胞数，并根据计数结果调细胞浓度为108/0.3 ml。按108单个核细胞(MNC)∶100 μl的比例加入A(FcR blocking reagent)充分混匀，再加入B(CD34 microbeads)充分混匀，于6-12℃下孵育30分钟。用PBS2洗1次，过30 μm的滤膜。用PBS2将细胞悬液调成3 ml，在磁性条件下过柱分离CD34+细胞，脱离磁场充分冲洗柱子。细胞计数后，用流式细胞仪测定细胞分离纯度。

　　巨核祖细胞的体外扩增

　　将CD34+细胞浓度调整为2×104/ml，加入24孔板，每孔终体积为1 ml。按不同细胞因子组合分为4组。A组：TPO/SCF/IL-6;B组：TPO/SCF/IL-6/IL-1;C组：TPO/SCF/IL-6/IL-3;D组：TPO/FL/IL-3/IL-6，每组复种3孔。细胞因子的终浓度为：IL-1、IL-3、IL-6、FL为10 ng/ml，SCF为50 ng/ml，TPO为20 ng/ml，采用含10%FCS的IMDM培养体系。培养体系中含L-Glu(终浓度为2 mmol/L)和2-巯基乙醇(终浓度为1×10-4mol/L)和适量青霉素和链霉素。将上述扩增体系置37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养15天，分别测定第5、10和15天培养体系的总细胞数，流式细胞仪测定CD41+细胞的百分含量，然后按以下公式计算其扩增倍数。

　　dnCD41+细胞的扩增倍数=每孔的dn总细胞数×CD41+细胞的百分含量/2×104

　　巨核祖细胞集落培养

　　用甲基纤维素半固体培养法培养。悬浮培养一定时间之后的细胞按1×103种植于Petri培养皿(35 mm，Lux)中培养。甲基纤维素半固体培养体系包括：0.9%甲基纤维素、1%牛血清白蛋白(BSA)，10-4 mol/L 2-巯基乙醇、20%胎牛血清(FCS)及TP0(20 ng/ml)，IL-3(10 ng/ml)、IL-6(10 ng/ml)，SCF(50 ng/ml)，加上IMDM，使总量达1 ml。培养皿置于37℃，5% CO2、饱和湿度培养箱中培养7-14天后原位固定，干燥后经瑞氏-姬姆萨染色标记细胞，采用倒置显微镜进行细胞集落计数。确认标准：每个CFU-MK至少含3个巨核细胞。

　　统计学分析

　　采用SPSS(V 12.0)软件包处理，进行多组间one-way ANOVA Test。P<0.05为显著性差异。

　　结 果

　　外周血CD34+细胞的富集

　　将免疫磁珠分选富集后的细胞用流式细胞仪检测，得到的CD34+、CD41+细胞含量分别是(91.38±1.99)%、(3.04±0.39)%。CD34+细胞仅占正常成人外周血的0.05%-0.2%，经细胞因子和(或)化疗动员后，外周血中CD34+细胞的含量可达1%-2%，显示富集后的CD34+细胞含量明显提高，而CD41+细胞含量仍然较低。

　　外周血来源的巨核祖细胞体外扩增效果

　　在培养第5天，用流式细胞仪检测实验各细胞因子组合MPB中CD41+巨核细胞百分含量。以D组最高，为(29.50±2.29)%，明显高于A组(16.68±0.54)%、B组(22.90±1.64)%、C组(18.99±1.63)% ( P<0.05)，3组均较扩增前有极显著性差异(P<0.01)。D组CD41+细胞的扩增倍数为93.97±17.27，明显高于A组(20.15±4.60)、B组(72.24±19.90)、C组(54.92±9.68)，具有显著性差异(P<0.01)。在培养第10天，各组CD41+巨核细胞所占比例较第5天减少，D组的CD4l+细胞含量仍明显高于A、B、D 3组(P<0.05)，D组CD41+细胞的扩增倍数为131.23±18.26，明显高于A组(28.84±2.28)、B组(100.18±10.73)、C组(74.13±11.25)，具有显著性差异(P<0.05)。在培养的第15天各组CD41+巨核细胞所占比例均较第10天明显下降( P<0.05)，CD41+细胞的扩增倍数较第10天均显著下降(P<0.01)(附表)。Table. Percentage of CD41+ cells in mobilized peri-pheral blood in groups with different combinations of cytokines added (略)

　　CFU-MK观察

　　取第5、10天的悬浮细胞分别进行CFU-MK培养，第3天开始出现巨核系集落形成，第14天集落明显形成(附图)。各组在不同时间均有集落生成，其中培养第5天的细胞形成的集落中，D组产生的CFU-MK数为83.33±10.02，明显高于其他3组(P<0.05)，培养第10天的细胞形成的集落中，D组产生的CFU-MK数最高为120.67±13.01，明显高于A组(53.67±7.77)、B组(92.00±6.56)、C组(82.00±8.19)，差异具有显著性(P<0.05)。以上结果显示，经体外诱导扩增第5、10天的巨核祖细胞仍具有增殖能力。

　　讨 论

　　巨核祖细胞增殖分化过程受多种造血生长因子和细胞因子的调控。TPO是公认的调节巨核细胞(MK)产生和血小板生成的最重要细胞因子，作用于巨核系发育的各个时期，促进巨核细胞增殖、分化、成熟和血小板的生成[2，3]。TPO是诱导扩增巨核系的首选细胞因子，它对某些细胞因子有协同作用，能加强诱导巨核系祖细胞增殖、分化的效能。FL是近年来发现的作用于造血干祖细胞的细胞因子，单用无明显作用，但可与TPO一起发挥协同作用，刺激巨核细胞系祖细胞的扩增[4]，与GM-CSF、IL-3联合能够刺激巨核系集落的生长，并且在体外长期维持MK生成[5]。

　　本研究实验的4种组合均能在体外诱导扩增巨核细胞的生成，TPO在其中起到了关键性的调控作用，其他因子具有协同作用。第10天D组(TPO/FL/IL-6/IL-3)与C组(TPO/SCF/IL-6/IL-3) CD41+细胞扩增倍数比较差异具有显著性(P<0.05)，提示了FL比SCF在巨核系的诱导扩增中能发挥更好的协同扩增作用。

　　经过大量实验研究，人们已用多种因子组合达到了巨核祖细胞的有效扩增。目前主要选用简单、高效、经济、适用于临床的最佳因子组合[6]。本研究发现，TPO/FL/IL-6/IL-3因子组合中，CD41+细胞及CFU-MK扩增的能力均明显高于A、B、C 3组(P<0.05)，该因子组合为体外扩增巨核祖细胞的最佳细胞因子组合。

　　在本研究中，第5天CD41+细胞所占比例较第0天明显增多(P<0.01)，CD41+细胞数也较前明显增多;第10天CD41+细胞所占比例虽较第5天下降，但随着体系总细胞的扩增，CD41+细胞的绝对数仍是较前增加的。第15天CD41+细胞所占比例比第10天明显减少，CD41+细胞数也随之明显减少，显示了CD41+细胞数在第10天达到增殖高峰，第15天迅速下降。这一结果提示，体外培养第10天为动员外周血来源的巨核祖细胞体外扩增的最佳时间。

　　总之，通过合理的细胞因子组合、适宜的培养条件，可以实现外周血来源的巨核祖细胞体外最大程度的定向扩增。但扩增后产物最终要应用于临床，一些临床前和临床实验已显示了体外扩增的MK能够安全地输给患者，病人耐受性好，没有严重的毒副作用和细菌污染，并且输入的MK在体内能够继续增殖[7，8]。我们设想，通过输注体外扩增的巨核祖细胞可能代替血小板的输注，取得更好的临床效果。

　　致谢：本研究工作得到香港中文大学附属威尔斯亲王医院儿科杨默研究员、广州南方医科大学南方医院血液科孟凡义教授和麒麟鲲鹏(中国)生物药业有限公司等的支持，特此致谢。

　　【参考文献】

　　1 Bertolini FJ，Battaglia M，Pedrazzoli P，et al. Megakaryocytic progenitors can be generated ex vivo and safely administered to autologous peripheral progenitor cell transplant recipients. Blood，1997; 89: 2679-2688

　　2 Majka M，Ratajczak J，Villaire G，et al. Thrombopoietin，but not cytokines binding to gp130 protein-coupled receptors，activates MAPKp42/44，AKT，and STAT proteins in normal human CD34+ cells，megakaryocytes，and platelets. Exp Hematol，2002; 30: 751-760

　　3 Drachman JG. Role of thrombopoietin in hematopoietic stem cell and progenitor regulation. Curr Opin Hematol，2000; 7: 183-190

　　4 Banu N，Deng，B，Lyman SD，et al. Modulation of haematopoietic progentitor development by FLT-3 ligand.Cytokine，1999;11:679-688

　　5 Piacibello W，Garetto L，Sanavio F，et al. The effects of human FLT3 ligand on in vitro human megakaryocytopoiesis. Exp Hematol，1996; 24: 340-346

　　6 Kratz-Albers K，Scheding S，Mohle R，et al. Effective ex vivo generation of megakaryocytic cells from mobilized peripheral blood CD34+cells with stem cell factor and promegapoietin. Exp Hematol，2000; 28: 335-346

　　7 Decaudin D，Vantelon JM，Bourhis JH，et al. Ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cells in autologous stem cell transplantation for relapsed malignant lymphoma. Bone Marrow Transplant，2004; 34: 1089-1093

　　8 Drayer AL，Smit Sibinga CT，Esselink MT，et al. In vitro megakaryocyte expansion in patient with platelet engraftment after autologous stem transplantation. Ann Hematol，2002; 81: 192-197.