多参数流式细胞术分析415例成人和儿童B-ALL白血病相关免疫表型

　　作者：刘艳荣,陈珊珊,常艳,付家瑜　　作者单位：北京大学血液病研究所; 1北京大学人民医院儿科 ， 北京 100044

　　【摘要】为了探讨FCM在微量残留病(MRD)检测中的意义，利用4-6组4色抗体组合，以CD45/SSC设门法对273例成人和142例儿童B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者进行了多参数流式细胞术(FCM)免疫分型检测和白血病相关免疫表型(leukemia associated immunophenotyping, LAIP)分析。结果表明：根据CD34和CD10的表达特点，可将B-ALL患者分为I型(CD34+CD10-);Ⅱ型(CD34+CD10+);Ⅲ型(CD34-CD10+);Ⅵ型(CD34-CD10-)。Ⅰ型和Ⅱ型患者LAIP的阳性比例分别为100%和92%，但Ⅲ型患者LAIP阳性率只有79.2%,显著低于Ⅰ型和Ⅱ型患者。总体B-ALL患者LAIP的检出率为90%，成人与儿童组无明显差异。而利用CD34/CD10/CD19/CD45一组抗体，LAIP检出率达到77.6%。结论： 90%成人和儿童B-ALL白血病患者具有LAIP，因此对这类患者适宜用多参数流式细胞术进行MRD监测。

　　【关键词】 急性B系白血病;白血病相关免疫表型;多参数流式细胞术

　　Leukemia-Associated Immunophenotypes in 415 Childhood and Adult Patients with B Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia by Multiparametric Flow Cytometry Analysis　LIU Yan-Rong，CHEN Shan-Shan, CHANG Yan，FU Jia-Yu，ZHANG Le-Ping1，WANG Hui， LI Ling-Di, ZHU Hong-Hu, LIU Gui-Lan1, LU Dao-Pei, HUANG Xiao-Jun　Institute of Hematology, Peking University, Beijing 100044, China; 1Department of Pediatrics, People Hospital, Peking University,

　　Beijing 100044, China

　　AbstractTo evaluate the significance of FCM in minimal residual disease(MRD)detection,the immunophenotyping and leukemia-associated immunophenotypes (LAIP)of leukemia cells from 273 adult and 142 childhood patients with B lineage acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) were detected by four to six antibody combinations of 4-color CD45/SSC gating multiparametric flow cytometry (FCM). The results showed that the B-ALL patients could be classified into 4 subtypes based on different expression CD34 and CD10 : subtype Ⅰ(CD34+/CD10-), subtype Ⅱ(CD34+/CD10+), subtype Ⅲ(CD34-/CD10+), subtype Ⅳ(CD34-/CD10-). The LAIP was observed in 100% and 92% patients of subtype Ⅰ and subtype Ⅱ, respectively, whereas only 79.2% in subtype Ⅲ. The incidence of LAIP in total B-ALL cases was 90% by using the antibodies detected in this investigation. There was no significantce different for incidence of LAIP between adult and pediatric patients. LAIP was observed in 77.6% of patients by labeling only CD34/CD10/CD19/CD45 4-color antibody combination. It is concluded that in 90% of childhood and adult B-ALL patients LAIP can be found, which suits MRD detection by multiparameter flow cytometry.

　　Key wordsacute B lineage leukemia; leukemia-associated immunophenotypes; multiparametric flow cytometry

　　B细胞型急性淋巴细胞白血病(B-ALL)免疫亚型的MIC诊断标准自1985年起一直沿用至今，并且被新的WHO分类标准所采用。该标准根据胞浆免疫球蛋白(cIg)和细胞核内抗原TdT及表面免疫球蛋白(sIg)、HLA-DR和CD10，将B-ALL分为：early-precursors-B-ALL, commom-B-ALL, pre-B-ALL和B-ALL4亚型。用流式细胞仪检测胞浆抗原的表达，操作较烦琐，有一定难度，且结果不稳定，因此其在临床的常规检测中应用受到限制。1997年 Jennings 等[1]提出将 B-ALL 分为： B-precursor-ALL, pre-B-ALL和B-ALL3亚型，又将B-precursor-ALL,分为CD10+和CD10-两类。该系统在MIC基础上加入CD34、CD20、CD22、CD24、CD9抗原。近几年多参数流式细胞术(FCM)的开发和应用促进了对正常B细胞分化阶段抗原表达的认识，但是否可通过简便的抗原检测而达到对B-ALL进行亚型的分型，本研究对此进行了初步探讨。虽然B-ALL患者的白血病细胞在抗原表达类型和出现的顺序与正常B祖细胞基本相似，但白血病细胞具有一些正常细胞不存在或存在比例较低的抗原表达特点，可作为辨认白血病细胞的标志，文献上对其称为白血病相关免疫表型(leukemia associated immunophenotypes， LAIP)[2]。利用FCM通过检测LAIP可对B-ALL微量残留病(MRD)进行监测，这一方法已成为与聚合酶链反应(PCR)并用的检测MRD的主要方法。目前国际上对B-ALL-MRD的检测结果多来自儿童患者，而且主要的研究对象为前体B-ALL(precursor)。而成人B-ALL患者在免疫表型尤其是LAIP与儿童患者是否存在区别?FCM-MRD的检测是否同样适合于成人B-ALL患者?及儿童和成人不同亚型B-ALL患者中LAIP的阳性率是否相同?均不十分清楚。本室在掌握了正常B祖细胞免疫表型的基础上[3]，对415例成人和儿童B-ALL患者的上述问题进行了研究，以探讨其在MRD检测中的意义。

　　材料和方法

　　研究对象

　　2000年8月至2005年6月在我室进行免疫分型检测的B-ALL患者共415例，其中初治409例，复发6例。成人(年龄大于14岁)组273例，中位年龄32岁(15-82岁)，男160例，女113例。儿童组142例，中位年龄9岁(2-14岁)，男89例，女53例。

　　B-ALL患者的免疫分型检测

　　取肝素抗凝的骨髓或外周血标本，利用我室设计的4色荧光(4种荧光素分别为：FITC、PE、APC、PerCP)直接免疫标记法进行B-ALL的免疫分型检测，以CD45/SSC(side scatter，侧向散射)设门，故每管均加CD45-PerCP抗体。主要标记4-6管4色抗体组合，检测的抗原分别为CD19、CD10、CD34、CD20，CD22，HLA-DR、CD13、CD33、CD14、CD5、CD7、CD2、CD38、CD117，CD11b等(CD13-FITC为美国Ancell公司产品，CD38-FITC为PharMingen公司产品，其余抗体均购自美国Becton Drckinson公司)。经流式细胞仪(FACSort型，Becton Dickinson公司，装备双激光管)测定时将正常淋巴细胞的CD45荧光值调到103左右。每份标本获取10 000个细胞。分析时以幼稚细胞群中抗原表达细胞>20%作为阳性。由于在仪器设定时将正常淋巴细胞的CD45荧光值调到103左右，此时正常B系祖细胞的CD45全部>101, 因此CD45抗原以90%细胞>101定为CD45 阳性(CD45+)，90%细胞<101定为CD45 阴性(CD45-)， 90%细胞>101到<102定为CD45弱阳性(CD45±)。B-ALL免疫分型的诊断标准参考文献[4]。

　　统计学处理

　　采用成对样本t检验和卡方检验。

　　结果

　　B-ALL免疫分型

　　本组B-ALL患者中，CD19全部阳性。由于正常B细胞的不同分化阶段CD34和CD10表达具有明显的阶段性，并且白血病细胞基本保留此特性，因此我们参考MIC分类标准，并主要根据CD34和CD10的表达，将B-ALL患者共分为4亚型(表1)：Ⅰ型:CD34+/CD10-，相当于MIC分类Early-precursor-B-ALL(Pre-pre-B-ALL); Ⅱ型:CD34+/CD10+,相当于普通B-ALL(c-B-ALL);Ⅲ型:CD34-/CD10+，相当于前B-ALL(Pre-B-ALL);Ⅳ型:CD34-/CD10-,相当于B-ALL。总体B-ALL中，以Ⅱ型患者最多，占63.1%，Ⅲ型和Ⅰ型分别为18.4%和14.5%;Ⅳ型最少，占3.8%。成人和儿童组比较，儿童组中Ⅰ型患者显著低于成人组(P=0.02)。其它各型比例在儿童与成人和与总体相比均无显著性差异(表1)。Table 1. Frequency of immunophenotypic subtypes in adult and child patients with B-ALL(略)

　　B-ALL患者LAIP分析

　　通过与正常 B祖细胞进行比较[2]，在总体B-ALL中LAIP的主要表现为：①抗原表达异常，以CD45表达异常减弱(underexpression)，缺如最为多见，在总体B-ALL患者中占38.6%。而且在4个亚型中均可见到，这说明完全丧失了分化阶段的特性。其它抗原表达异常包括CD19、CD10、CD34异常高表达(overexpressed或 strong positive)和异常低表达(underexpressed 或dim positive); ②非同步抗原表达，如Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型B-ALL患者的白血病细胞，在正常CD19+B系细胞相应发育阶段除CD34和CD10抗原外， CD22、CD38和CD20表达应为CD22+CD38+CD20-、CD22+CD38+CD20+/-和CD22+CD38-CD20+;但白血病细胞可出现CD34+CD20+、CD34-CD10-CD20-、CD34-CD10-CD22-、CD34+CD38-、CD10+CD38-非同步抗原表达异常;③交叉系列抗原表达，如同时表达髓系和T系标志(表2和3)。通过本研究所检测的抗体，415例B-ALL患者中373例(89.9%)患者具有可供MRD检测的LAIP，其中利用CD10/CD34/CD19/ CD45一组抗体，LAIP的检出率达到77.6%。 Table 2. Incidence of LAIP in 415 adult and child patients with B-ALL(略)

　　Note: st+-strong positive.

　　B-ALL各亚型中白血病相关的免疫表型分析

　　本研究所检测的主要抗原的异常表达在各亚型中的比例见表3和表4。CD45和CD38异常弱表达和CD34、CD19和CD10的强表达主要见于Ⅱ型患者，使Ⅱ型患者总体LAIP阳性率达92.4%。CD33和CD56的异常表达以Ⅰ型患者多见，且正常CD19+B祖细胞基本不存在CD34+CD10-表型，此型患者全部为LAIP+，即均可通过免疫表型检测MRD。Ⅲ型患者由于CD34阴性，CD10表达也已经减弱，只有CD20全部阴性占56.4%,高于Ⅰ型和Ⅱ型(P<0.05)，但其他标志异常率也较低，其总LAIP+率只有79.2%，比Ⅰ和Ⅱ型低，但只与Ⅰ型相比有统计学差异(P=0.000)。对Ⅳ型患者，由于其CD34和CD10均为阴性，因此失去了2个非常有意义的标志，LAIP阳性率最低。与其它3型比均有统计学差异(P=0.001)。但我们发现6/7例患者CD20为阴性，而此期的正常B细胞，CD20应强阳性，因此通过CD20的检测可能利于Ⅳ型患者MRD的监测。虽然表4显示Ⅳ型患者LAIP阳性率为56.2%，但LAIP阴性的7名患者均未检测CD22和CD20，因此，如果每位Ⅳ型患者均检测此两种抗体，则实际LAIP阳性率可能会大大增加。Table 3. Frequency of LAIP positive patients in subtype of B-ALL (略)

　　成人和儿童组B-ALL患者白血病相关的免疫表型分析

　　表4显示成人和儿童组B-ALL患者白血病相关的免疫表型阳性比例，儿童组中LAIP阳性率为90.1%，成人组为89.7%, 两者无统计学差异。而儿童和成人B-ALL各亚型之间及与总体之间均无显著差异。这一结果说明FCM同样适合于成人B-ALL患者MRD的监测。Table 4. Percentage of LAIP positive patients in subtype of B-ALL(略)

　　讨论

　　近几年，由于多参数FCM的建立和应用，我们对正常B细胞分化阶段抗原表达有了新的认识。文献报道和我们的结果均说明利用CD34/CD10/CD19/CD45可将正常B细胞从最早期到成熟期进行分型。而1985年提出的MIC标准所依据的抗原中CD19和HLA-DR在B细胞分化全程表达，而对B-ALL来讲，HLA-DR不是一个特异性的标志，因此在诊断B-ALL进行时可不必检测此抗原。TdT和CD10的表达在正常B祖细胞不同分化阶段具有明显的阶段性，而文献报道[5]和我们的结果证明，正常B祖细胞中CD34与TdT的表达具有一致性。虽然文献报道pre-B-ALL TdT为阳性,而相应的同期正常B祖细胞CD34和TdT应为阴性，但Jennings等[1]与我们的结果，均显示 pre-B-ALL中CD34为阴性。这说明TdT在B-ALL中的表达丧失了分化阶段特异性，因此利用CD34抗原作为亚型的分型标志优于TdT。cIg和 sIg是很好的抗原标志，不足之处是cIg的标记操作较繁琐，同时标记cIg和 sIg也增加检测费用。我们检测了B祖细胞中cIg和sIg的表达，结果与文献报道相同[7]，cIg表达见于CD34-CD10+阶段，属于CD19+B系分化的第Ⅱ期，sIg表达见于CD34-CD10dim阶段，属于B系分化的第Ⅲ期,因此我们主要依据CD34和CD10的表达将B-ALL患者分为4种亚型。对Ⅰ型B-ALL，我们的结果说明在正常CD19+B祖细胞中无明显的CD34+CD10-细胞，而近几年多参数FCM检测的文章中也未证明存在此群细胞，但有文献报道存在TdT+CD10+CD19-和CD34+CD10+CD19-早期幼稚细胞[5,6]。因此CD34+CD10-CD19+细胞是否属于B细胞分化的最早期阶段，尚无定论。但B系ALL患者中，有14%患者CD34阳性而CD10阴性，且与MIC分型中early Precursors-B-ALL相似，故将其定为Ⅰ型。MIC分型中的c-B-ALL，指CD10阳性但cIg和sIg均阴性的患者，实际上与CD34+CD10+发育阶段一致。Ⅲ型与MIC分型中的Pre-B-ALL相同。我们未系统检测B-ALL中CD34的TdT关系，但文献报道，Pre-B-ALL患者TdT+/-。现在看来，CD34+TdT-应属于LAIP的一种。本组儿童B-ALL的分类结果与1993年前依据MIC标准进行分型的大宗标本的结果[8]基本一致。但当时对成人B-ALL患者的亚型分类中，由于缺乏cIg的资料，因此成人中Pre-B-ALL的比例不详。这说明成人B-ALL中cIg的检测并不普遍，影响了成人B-ALL的亚型分型。本研究利用CD34/CD10/CD19/CD45抗体组合，不仅可对B-ALL进行分型，又弥补了MIC中的不足，还可用于LAIP检测和MRD随访。目前对CD22抗原表达的认识已有更新。Lucio[9](1999)、McKenna[5](2001)和我们的结果均证明，在B系祖细胞分化发育的早期，即表达CD22，且CD20主要为阴性，因此CD34+CD22+CD20-是Ⅰ期B祖细胞的正常表型，并非LAIP。而2002年发表的WHO白血病和淋巴瘤的新分类标准中[10]，还认为早期的B祖细胞为CD22阴性。1999年前发表的文章中，有将CD34和CD22同时阳性和CD34+CD22+CD20-归于LAIP[1]。现在分析，这些应为正常表型。造成如此大差异的主要原因是CD22抗体所连接的荧光素不同，如CD22-FITC，该荧光素的荧光强度较弱。相似的原因可能造成不同的文献某些抗原表达的差异，如髓系标志的表达。而FITC和PE标记的CD20的表达基本是一致的。FCM主要通过检测LAIP来鉴别白血病细胞。对B-ALL患者，文献报道LAIP主要有4种表现[11-13]：①非同步抗原同时表达，如CD34和胞浆μ链同时阳性; ②交叉系列抗原表达，如B-ALL细胞同时表达髓系和T系标志;③抗原表达量异常,如CD10、CD34、CD19过强表达和CD38，CD45等表达缺失及低表达;④光散射信号改变,包括侧向光散射、前向光散射。本研究结果中，LAIP主要表现为抗原表达量的异常，以CD45弱表达或表达缺失最为常见，其它抗原异常依次为CD19、CD38、CD10、CD34。交叉系列抗原：髓系或T系表达占24%，而CD56表达率达到21%。非同步抗原同时表达主要见于CD20与 CD38。而光散射信号改变在发病时表现较明显，但在MRD的检测中，难以利用此标志进行鉴别。根据本研究所覆盖的抗体数量，发现90%的B-ALL患者具有LAIP，可利用FCM检测MRD。此比例与文献报道相似。但已发表的文章多数只研究了前体B-ALL(precursor-B-ALL)，而我们的分析对象是所有B-ALL患者，包括成熟型B-ALL，因此本研究更全面地反映了B-ALL的异常

　　疫表型特点。我们首次分析了不同亚型B-ALL患者LAIP的检出率。结果表明，对Ⅰ型(CD34+CD10-)患者，100%患者适用于FCM-MRD检测。对Ⅱ型(CD34+CD10+)患者，其LAIP的检出率可达92.4%,与文献报道相似。但对于Ⅲ型(CD34-CD10+)患者，LAIP的检出率明显减低只有79.2%。本组资料中，有1例检测失败者也属此型。这说明部分Ⅲ型B-ALL患者难以利用FCM检测MRD。Ⅳ型患者比例较低，如果增加CD20和CD22的检测，可望增加此型患者FCM-MRD的检测比例。对儿童和成人B-ALL患者，本研究材料表明：儿童和成人B-ALL的LAIP阳性率无明显不同。这说明FCM同样可适宜成人B-ALL MRD的检测，而成人ALL患者预后明显差于儿童患者，因此应加强治疗后MRD的监测，以提高成人ALL患者的预后判断。

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