丹参干预Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎大鼠血清D二聚体的变化△

　　作者：韩乔燕,顾健*,薛永骥,刘丹　　作者单位：扬州大学临床医学院血液科 扬州市血液研究所，扬州225001

　　【摘要】目的观察丹参对Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎(CIA)大鼠血清D二聚体(DD)的影响，探讨丹参干预类风湿性关节炎易栓状态的实验研究。方法 将48只SD大鼠随机分为5个实验组,皮下注射Ⅱ型胶原诱导类风湿性关节炎大鼠模型，应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组大鼠血清DD水平。结果 所有实验组DD水平均高于空白组(P<0.01)。模型组的DD水平高于丹参组、MTX组和丹参+MTX组;丹参组DD水平高于MTX组及丹参+MTX组;MTX组DD水平高于丹参+MTX组(P<0.05)。结论 联合使用丹参和MTX治疗的明显效果有利于改善类风湿性关节炎的易栓状态。

　　【关键词】 丹参; 甲氨喋呤; 类风湿性关节炎; D二聚体; 大鼠

　　Influence of Salvia Miltiorrhiza on the Serum DDimer Levels of ⅡCollogen Induced Rheumatoid Arthritis in Rats HAN Qiaoyan，GU Jian，XUE Yongji，LIU Dan (Institute of Hematology，Yangzhou University，Yangzhou 225001，China)

　　Abstract: Objective To observe the influence of Salvia Miltiorrhiza on the serum Ddimer levels of CⅡinduced arthritis(CIA) in rats.To explor the effect of Salvia Miltiorrhiza interfering in the prethrombotic state of rheumatoid arthritis.Methods 48 SD rats were randomly divided into five groups.The rat rheumatoid arthritis model was established by subcutaneous injection of Ⅱcollogen.The serum Ddimer levels of the five groups were tested with the enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Results The serum Ddimer levels of all the other groups were notably higher than those of the normal group (P< 0.01).The serum Ddimer levels of the model group were higher than those of the Salvia Miltiorrhiza group,MTX group,Salvia Miltiorrhiza and MTX group; The serum Ddimer levels of the Salvia Miltiorrhiza group were higher than those of the MTX group,Salvia Miltiorrhiza and MTX group; The serum Ddimer levels of the MTX group were higher than those of the Salvia Miltiorrhiza and MTX group(P<0.05).Conclusion The effects of combined Salvia Miltiorrhiza and MTX are significantly better than those of using them alone.Combined Salvia Miltiorrhiza and MTX are beneficial to improve the prethrombotic state of rheumatoid arthritis.

　　Key words: Salvia Miltiorrhiza; Methotrexate; Rheumatoid arthritis; Ddimer; Rat

　　类风湿性关节炎 ( rheumatoid arthritis，RA)是一个累及周围关节为主的多系统性炎症性的自身免疫病。滑膜血管翳形成是RA的一个重要病理改变，早期血管翳内微血栓形成，血流迟滞,间质水肿,纤维蛋白沉积等微血管障碍, 从而诱发易栓症。Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎模型是目前国际公认的研究RA的模型[1] ,在临床、免疫病理反应等方面与实际极为相似，因此，我们以Ⅱ型胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎模型为对象，检测大鼠血清D二聚体(DD)水平变化，探讨丹参对RA易栓状态的干预作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 48只雌性近交系SD大鼠，清洁级，4～6周龄，平均体重为190±15 g，购于南京医科大学实验动物中心;鸡Ⅱ型胶原(chicken collagenⅡ, CCⅡ)购于美国Sigma公司;冻干注射用灭毒卡介苗(BCG),购自上海生物制品研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验动物分组 48只大鼠随机分为5组：①空白组(n=8);②模型组(n=10);③丹参组(n=10);④甲氨喋呤组(MTX组，n=10);⑤丹参+甲氨喋呤组(丹参+MTX组，n=10)。

　　1.2.2 Ⅱ型胶原的配制 取液体石蜡4 ml和羊毛脂2 ml混匀并高压灭菌。加入BCG 60 mg，充分混匀。将Ⅱ型胶原30 mg溶于6 ml的0.01M 乙酸溶液中，浓度为5 mg/ml，4℃ 过夜，充分溶解，然后和完全弗氏佐剂(CFA)等体积于冰浴中混合，充分乳化，制成稳定的Ⅱ型胶原乳剂12 ml，每毫升含5 mg BCG和2.5 mgⅡ型胶原。

　　1.2.3 建立动物模型 每只0.1 mlⅡ型胶原乳剂在大鼠的左后足跖皮内注射诱导RA大鼠模型，第21天时再次以原剂量尾根部皮内多点激发注射免疫诱导;空白组以生理盐水注射，方法同模型组。所有动物均在清洁环境中饲养。

　　1.2.4 给药方法 丹参组、MTX组、丹参+MTX组于初次免疫次日灌胃给药;丹参经胃灌服丹参(纯品，江阴天江药业有限公司)5 g/kg•d-1，用蒸馏水稀释成0.5 g/ml,每天灌服1次;MTX经胃灌服MTX(上海医药有限公司信谊制药总厂)1.75 mg/kg•周-1,用蒸馏水稀释成0.35 mg/ml,每周灌服1次;模型组大鼠每天灌服2 ml蒸馏水;空白组自由饮水。

　　1.2.5 关节炎指数(arthritis index, AI)评定[2] 采用关节评分法(0～4级)。评定依据为关节红肿程度和范围以及关节肿大和变形情况。0分：无关节炎;1分：有红色斑点或轻度肿胀;2分：关节部位中度肿胀;3分：严重肿胀;4分：严重肿胀且不能负重。每只大鼠四肢最高总分为16分。

　　1.2.6 血清DD的测定 所有大鼠于造模第35天采血，分离血清作为检测标本。DD测定采用ELISA法,试剂盒由上海麦沙生物科技有限公司提供,操作严格按照试剂盒说明进行。

　　1.3 统计学处理 采用Excell 2003 和SPSS 13.0统计软件对数据进行处理。所有数据以x±s 表示,不同组间用方差分析及t检验。

　　2 结 果

　　2.1 关节症状 CIA大鼠造模后饮食及活动减少, 关节出现红肿、瘀斑，后期可见毛发枯燥无光泽;而给药组上述表现不同程度地减轻;正常组饮食及活动如常，关节无异常改变。

　　2.2 AI评定结果。见图1。

　　图1 AI评分趋势曲线

　　模型组、丹参组、MTX组、丹参+MTX组于2周前无明显区别，随着免疫时间延长, AI积分增加，于第3周达高峰，3周后呈下降趋势，但丹参组、MTX组、丹参+MTX组均低于模型组，且丹参+MTX组低于丹参及MTX单用组。

　　2.3 血清DD测定结果 见表1。 表1 各组大鼠血清DD的测定结果比较模型组、丹参组、MTX组、丹参+MTX组大鼠血清DD水平明显高于空白组(P<0.01)。模型组DD水平高于丹参组、MTX组及丹参+MTX组，丹参组DD水平高于MTX组及丹参+MTX组，MTX组DD水平高于丹参+MTX组(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　RA是一种以慢性进行性关节病变为主的自身免疫性疾病，除侵犯关节外，还可累及肺、神经和血管等多系统，其中血管病变较常见,血管壁内免疫复合物沉积和单核细胞浸润，从而表现为毛细血管炎和静脉炎[3,4]。血管壁的损伤会引起组织液人血，激活外源性凝血途径，这种变化持续存在导致凝血酶大量生成，使患者处于血栓前状态。同时血管内皮损伤并发血栓形成可导致局部组织坏死或梗死，静、动脉血栓形成可导致心、脑、肾、肺等脏器及神经系统的严重损伤和功能障碍。滑膜血管翳形成是RA的一个重要病理改变,早期血管翳内纤维蛋白沉积，处于高凝状态，可诱发血栓形成。此外，由单核-巨噬细胞产生的细胞因子如 TNFα、IL1等在 RA 的滑膜急性炎症、骨与软骨破坏的病理改变中发挥重要作用。TNFα 还能下调凝血酶调节蛋白(thrombomodulin,TM)在内皮细胞的基因转录和表面表达水平[5] ，从而减弱TM的抗凝与抑制炎症反应的作用。多种炎症介质不仅直接损伤内皮细胞，促进凝血反应，诱导内皮细胞和单核细胞表达组织因子(TF)，合成释放各种黏附分子、炎症介质、趋化因子，扩大炎症反应和促进血栓形成。

　　现代药理试验证实丹参具有抗血小板黏附、聚集和释放的作用，能降低血液黏度，加快红细胞流速，增加冠状动脉血流量，增强纤维蛋白溶解酶系统活性，调节凝血系统功能，参与机体的免疫调节。Ding等[6]的研究还发现丹参能明显改善TNFα 诱导的内皮细胞渗透性，有利于抑制炎症反应和血栓形成。MTX是一种用于RA病人治疗的有效药物,可选择性地调节T细胞和巨噬细胞的细胞因子产生，可直接抑制滑膜细胞及免疫炎症细胞的增殖、诱导细胞凋亡及抑制中性粒细胞的趋化。由于炎症是血栓性疾病的重要组成部分，MTX通过抑制炎症反应，间接地抑制了血栓的形成。DD由交联的纤维蛋白被纤溶酶溶解后形成的纤维蛋白降解产物,其升高表明体内有凝血酶形成及继发性纤溶。本实验观察CIA大鼠DD水平变化发现：CIA大鼠模型组DD水平明显高于空白组(P<0.01，表1)，且AI评分也相应增高，表明CIA大鼠有凝血酶形成及/或继发性纤溶的存在，与免疫炎性诱导该病理变化有关。因此，DD的检测利于RA患者的血栓前状态的早期诊断,并对观察临床抗凝疗效，控制易栓状态的发展，改善预后均有重要意义。实验结果显示：丹参+MTX组降低DD水平最为显著(P<0.05)，同时AI评分也相应降低，表明丹参联合使用MTX治疗效果明显优于药物单用组，有利于改善RA的易栓状态。

　　【参考文献】

　　[1] 吕爱平,吴 萍,鞠大宏,等.用胶原诱导性关节炎探讨中药治疗类风湿性关节炎的方法学研究[ J ]. 中国中药杂志,2004, 29 (6):5050506.

　　[2] YIN G, LIU W, AN P, et al. Endostatin gene transfer inhibits joint angiogenesis and pannus formation in inflammatory arthritis[ J ]. Mol Therapy, 2002，5(Part 1):547554.

　　[3] MEDIWAKE R , ISENBERG DA , SCHELLEKENS GA. Use of anticitrullianted peptide andRA33 antibodies in distinguish erosive art hritis in patient s wit h systemic lupus eryt hematosus and rheumatoid art hritis[ J ]. Ann Rheum Dis ,2001 ,60(1) :6778.

　　[4] BIZZARO N , MAZZANTI G , TONUT TI E. Diagnostic accuracy of the anticitrulline antibody assay for rheumatoid arthritis[ J ]. Clin Chem ,2001 ,47(6) :10891096.

　　[5] ESMON CT.Crosstalk between inflammation and thrombosis[ J ].Maturitas, 2004,47(4): 305 314.

　　[6] DING, M., YE, T.X., ZHAO, G.R., et al. Aqueous extract of Salvia miltiorrhiza attenuates increased endothelial permeability induced by tumor necrosis factoralpha[ J ]. Int. Immunopharmacol,2005,5,16411651.