血管内皮细胞线粒体膜电位与缺氧及血管紧张素Ⅱ的相关性

　　作者：刘玉,胡建林,李鸣皋,马贵喜　　作者单位：1.解放军第三军医大学附属西南医院 呼吸科，重庆 400038;解放军海军总医院 2.海军航空潜水医学中心，3.血液科，北京 100037

　　【摘要】目的观察缺氧及血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)对血管内皮细胞(VEC)线粒体膜电位的影响。方法 建立VEC缺氧损伤模型;实验设为空白对照组、缺氧组、Ang-Ⅱ作用组、缺氧加Ang-Ⅱ作用组等四组。细胞经过Rhodamine 123负载后，用激光共聚焦显微镜测定VEC内Rhodamine 123的荧光强度代表线粒体膜电位。结果 VEC分别经过缺氧及Ang-Ⅱ损伤后，线粒体膜电位明显降低(P0.01); 缺氧与Ang-Ⅱ联合作用可引起VEC线粒体膜电位较单纯缺氧或单纯Ang-Ⅱ作用进一步降低(P0.05)。结论 缺氧及Ang-Ⅱ可引起VEC线粒体膜电位明显降低，造成VEC损伤。

　　【关键词】 缺氧;血管紧张素Ⅱ;线粒体膜电位;血管内皮细胞

　　Correlation of Mitochondria Membrane Potential of Vascular Endothelial Cells to Hypoxia and Angiotesin

　　Liu Yu1, Hu Jian-lin1, Li Ming-gao2, Ma Gui-xi2, Han Lei2, Huang You-zhang3 (1. Department of Respiratory Medicine, Southwest Hospital of Third Military Madical University, Chongqing 400038, China; 2. Aviation & Diving Medical Center; 3. Department of Hematology, PLA Navy General Hospital, Beijing 100037, China)

　　Abstract： Objective To study the effect of hypoxia and angiotesinⅡ (AngⅡ) on mitochondria membrane potential (MMP) of vascular endothelial cells (VECs). Methods Hypoxia-induced injury model of VECs was established, and then cultured VECs were divided into four groups control group, simple hypoxia group, simple AngⅡ group, hypoxia+AngⅡ group, which were loaded with Rhodamine 123. MMP was detected by laser confocal microscopy to see if there were any differences among the groups. Results Compared with control group, decrease in MMP was observed either in the hypoxia group or in the Ang Ⅱ group (P0.01). This change was clearer in the hypoxia+ AngⅡ group than in any of the other groups (P0.05). Conclusion Hypoxia or AngⅡ could significantly decrease MMP of VECs, and injure VECs.

　　Key words： hypoxia; angiotesinⅡ; mitochondria membrane potential; vascular endothelial cell

　　血管内皮细胞(VEC)是血液和组织间进行代谢交换的屏障，可以合成和分泌多种生物活性物质，在调节血管收缩舒张功能、维持内环境稳定等方面具有重要意义。缺氧是导致VEC损伤的极为常见的病理因素，血管紧张素-Ⅱ (Ang-Ⅱ)是肾素-血管紧张素系统直接作用于血管床使血管收缩的重要的血管活性肽，在原发性高血压、动脉粥样硬化和心衰等疾病的发生发展过程中起重要作用[1~2]，在本研究中，通过培养的人大动脉血管内皮细胞分别观察了缺氧和Ang-Ⅱ对线粒体膜电位的影响，并进一步探讨缺氧和Ang-Ⅱ引起血管内皮细胞损伤的内在机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂和仪器 D-Hanks液(HyClone,美国)，人大动脉血管内皮细胞(CBI公司提供的人大动脉血管内皮细胞体系)，血管内皮细胞培养液及血管内皮细胞生长因子(CBI公司配套提供)，胰蛋白酶(华美生物工程公司)，二甲基亚砜(美国BIO-RAD公司)，Rhodamine 123荧光探针(美国BIO-RAD公司)，Ang-Ⅱ(Sigma公司)，缺氧用混合气体(95%N2，5%CO2， 北京市特殊气体供应公司)，35 mm 培养皿(丹麦NUNC公司)，细胞培养箱(Asheville.NC公司)，超净工作台(北京冠鹏净化设备有限公司)，光学显微镜(Olympus，Japan)，激光共聚焦显微镜MRC-1024(美国BIO-RAD公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 血管内皮细胞的传代培养 取人大动脉血管内皮细胞，常规复苏后，将细胞加入含有LSGS的Medium200培养基中制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105ml，取该细胞悬液10 ml 接种于75 cm2的无菌培养瓶中，置于37℃、湿度95%、含体积分数为5%的CO2孵箱中培养，隔天更换培养液，细胞70%~90%融合时用1 gL 胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化传代，细胞传代时的接种浓度为1×105ml。当细胞传至第三代时，将细胞接种于35 mm 培养皿中继续培养，观察细胞70%~90%融合后，准备进行实验。

　　1.2.2 缺氧模型 将培养皿放入备有进气口和出气口的密闭容器中，保持出气口开放，将缺氧用混合气体以10 Lmin 的流量经进气口充入密闭容器，持续5 min 后，同时关闭进气口和出气口，将密闭容器置于37 ℃ 的培养箱中缺氧培养60 min。

　　1.2.3 实验分组与处理 将培养的内皮细胞按每皿1组分为4组：(1)对照组：加入细胞培养液180 μl 及生理盐水20 μl;(2)缺氧组：加入细胞培养液180 ul 及生理盐水20 μl，按上述缺氧模型方法造成缺氧状态;(3)Ang-Ⅱ作用组：加入细胞培养液180ul，生理盐水10 μl，Ang-Ⅱ10 μl，使培养液中Ang-Ⅱ终浓度为10~7 molL;(4)缺氧加Ang-Ⅱ作用组：加入细胞培养液180 μl，生理盐水10 μl，Ang-Ⅱ10 μl，使培养液中Ang-Ⅱ终浓度为10 -7 molL，按上述缺氧模型方法造成缺氧状态。对照组、单纯Ang-Ⅱ作用组分别在加入生理盐水或Ang-Ⅱ作用60 min 后进行细胞内MMP的测定，其余各组分别在缺氧60 min 后进行细胞内MMP的测定。

　　1.2.4 血管内皮细胞MMP的测定

　　1.2.4.1 测定原理 Rhodamine 123是一种阴离子亲脂性荧光染料，本身具有荧光，进入细胞后，可以选择性地富集在线粒体上，线粒体富集Rhodamine 123的量随MMP的变化而变化。通过测定线粒体Rhodamine 123荧光强度，反映MMP及其变化情况。

　　1.2.4.2 Rhodamine123的负载 将上述各组培养皿中的细胞用D-Hanks液洗涤3遍，各皿内加新鲜培养液2 ml，再加入配制好的Rhodamine 123荧光探针(5 gL) 2 μl 负载，其终浓度为5 mgL，放入37 ℃ CO2孵箱中孵育30 min。吸去Rhodamine 123荧光探针负载液，用D-Hanks液轻轻洗细胞3遍，充分洗去剩余染料，加200 μl 细胞培养液，避光保存15 min。

　　1.2.4.3 线粒体膜电位的测定 应用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内Rhodamine 123的荧光强度(激发波长488 nm，发射波长526 nm)，每组选取25个活细胞，每个细胞间隔2 s 扫描1次，共扫描16次，记录16个荧光强度数值，取平均值代表该细胞的MMP。

　　1.3 统计学方法 全部数据输入计算机，在SPSS11.0统计软件上分析，结果以均值±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　与对照组相比，单纯缺氧后线粒体Rhodamine 123荧光强度明显降低(P0.01)，表明缺氧处理可导致细胞MMP显著下降;与对照组相比，在常氧条件下，加入Ang-Ⅱ后，Rhodamine 123荧光强度明显降低(P0.01)，表明Ang-Ⅱ可导致细胞MMP显著下降;缺氧加Ang-Ⅱ联合作用后，线粒体Rhodamine 123荧光强度与单纯缺氧组相比降低非常显著(P0.01)，与单纯Ang-Ⅱ作用组相比降低显著(P0.05)，表明缺氧与Ang-Ⅱ联合作用对细胞MMP有显著影响，且比单纯缺氧作用和单纯Ang-Ⅱ作用更显著。见表1。 表1 缺氧、Ang-Ⅱ对VEC线粒体膜电位的影响与对照组比较，①P0.01;与单纯缺氧组比较，②P0.01;与单纯Ang-Ⅱ组比较，③P0.05

　　3 讨论

　　线粒体是动物细胞生成ATP的主要地点，是促进细胞能量转换、参与细胞凋亡的重要细胞器。人体的ATP有95%为线粒体所提供。合成的ATP通过线粒体内膜ADPATP载体与细胞质中的ADP交换进入细胞质，参与细胞的各种需能过程，因此线粒体与细胞维持正常功能密切相关。线粒体在呼吸氧化过程中，将所产生的能量以电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧造成质子及其他离子浓度的不对称分布而形成线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)。正常的MMP是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件, MMP的稳定有利于维持细胞的正常生理功能。近年来研究发现多种细胞在不同因子作用下发生凋亡时均伴有MMP的下降，线粒体氧化磷酸化过程中起偶联作用的MMP在细胞凋亡早期病理变化以前就开始下降，该过程早于DNA片段化[3]。

　　血管内皮细胞作为组织与血液间的第一道屏障，是最先感受缺氧的细胞之一，也是Ang-Ⅱ攻击的重要靶细胞之一。由于在正常机体环境中，缺氧性疾病对机体VEC的损伤不仅仅在于缺氧本身，还同时会受到神经体液因素的影响，在体液因素中，Ang-Ⅱ是最主要的损伤因素之一。有研究发现，缺氧可引起小肠上皮细胞MMP下降[4];Ang-Ⅱ可影响离体心肌线粒体呼吸功能并使细胞MMP降低[5]，而把缺氧与Ang-Ⅱ一起作用于VEC来观察MMP变化的研究报道不多。本实验采用人大动脉血管内皮细胞为观察对象，用线粒体特异性染料Rhodamine 123进行标记，用来反映VEC的MMP。Rhodamine 123是一种阴离子亲脂性荧光染料，本身具有荧光，对细胞膜和线粒体膜均具有很好的通透性，在活细胞内主要与线粒体结合，被线粒体吸收后可与线粒体内的H+发生中和反应，使荧光淬灭。线粒体对Rhodamine 123摄取过程是依赖膜电位差的摄取与逆向扩散的综合效应，因而是一种动态变化。染色后胞浆和线粒体中均有荧光探针，但由于线粒体基质的电位相对于胞浆内的电位低很多，故线粒体内的荧光强度比胞浆内的荧光强度高很多。Rhodamine 123荧光强度降低，反映线粒体数量减少和功能降低。本研究结果显示：VEC经过缺氧或Ang-Ⅱ作用后细胞内线粒体膜电位均显著下降，缺氧与Ang-Ⅱ联合作用后VEC内线粒体膜电位进一步下降。关于缺氧或Ang-Ⅱ引起VEC内线粒体膜电位下降的机制可能与下列因素有关：(1)大量研究证实几乎所有致细胞凋亡的刺激因素都会诱发线粒体结构破坏和功能障碍[6~7]。缺氧引起线粒体结构与功能损害的原因目前认为与氧化应激有关，缺氧促进机体活性氧生成，活性氧生成过多可直接或间接损伤线粒体膜，造成MMP下降[8]，而Ang-Ⅱ也可以促进氧自由基的产生[9]，从而引起MMP的下降;(2)在线粒体内、外膜交界处存在一种蛋白性孔道—线粒体膜通透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore，MPT)，MMP的下降与MPT的开放密切相关，而且可作为线粒体膜通透性转变的重要征象，是发生细胞凋亡的重要环节[10]，MPT孔的开放受线粒体Ca2+浓度的升高直接或间接调控[11]，线粒体内Ca2+的缓慢积累导致线粒体内Ca2+超载，启动高导性的MPT孔开放，导致MMP下降，而缺氧与Ang-Ⅱ均可引起线粒体Ca2+浓度的升高[12~13]。可见，Ang-Ⅱ与缺氧引起线粒体MMP下降的途径是相似的，这也许是缺氧与Ang-Ⅱ联合作用后VEC内MMP进一步下降的原因。

　　综上所述，缺氧与Ang-Ⅱ均可引起VEC内MMP的下降，而缺氧与Ang-Ⅱ联合作用后VEC内MMP进一步下降。细胞内MMP下降机制研究的不断深入将有利于进一步了解细胞凋亡的机制，为细胞保护药物的开发利用提供有力的依据。

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