探针D13S319和D13S25检测慢性淋巴细胞白血病13q14缺失

　　作者：李丽,徐卫,仇海荣,程月新,张苏江　　作者单位：南京医科大学第一附属医院、江苏省人民医院 血液科 210029

　　【摘要】为了探讨慢性淋巴细胞白血病(CLL)中13q14的缺失情况，采用SpectrumOrangeTM直接标记的位于13q14的序列特异性DNA探针D13S319、D13S25和应用间期荧光原位杂交(IFISH)技术检测24例CLL患者13q14缺失[del(13q14)]情况。结果显示：24例CLL中用D13S319探针检测，del(13q14)异常10例(41.7%);用D13S25探针检测，del(13q14)异常11例(45.8%)，两个位点同时存在del(13q14)异常者9例(37.5%)。del(13q14)在不同的Binet分期中分别为A期4/7(57.1%)，B期3/7(42.9%)，C期5/10(50%)，在各组间无显著性差异(P>0.05)。结论：CLL患者13q14缺失区域可能位于D13S319和D13S25之间，FISH是一种检测del(13q14)异常快速而准确的方法。

　　【关键词】 慢性淋巴细胞白血病;D13S319探针;D13525探针;13q14缺失;间期荧光原位杂交

　　Detection of 13q14 Deletion in Chronic Lymphocytic Leukemia by Using Probes D13S319 and D13S25 LI Li, XU Wei, QIU HaiRong, CHENG YueXin, ZHANG SuJiang, LI JianYong Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu Province People Hospital, Nanjing 210029, China

　　Abstract To investigate the incidence of 13q14 deletion [del (13q14)] in chronic lymphocytic leukemia (CLL), Spectrum OrangeTM labeled sequencespecific DNA probes D13S319 and D13S25 for 13q14 and interphase fluorescence in situ hybridization (IFISH) were applied to detect del (13q14) in 24 patients with BCLL. The results showed that among 24 patients, 10 patients (41.7%) had del (13q14) with D13S319, 11 patients (45.8%) had del (13q14) with D13S25, and 9 patients (37.5%) had del (13q14) with both D13S319 and D13S25. The incidence of del (13q14) in Binet stage A, B, C was 4/7 (57.1%), 3/7 (42.9%) and 5/10 (50.0%) respectively by D13S319 probe detection, and there was no significant difference between three Binet stages (P>0.05). It is concluded that the region of loss at 13q14 locates between D13S319 and D13S25 in CLL, and the IFISH is a rapid and sensitive technique for analysis of del(13q14) in CLL.

　　Key words chronic lymphocytic leukemia; D13S319 probe; D13S25 probe; 13q14 deletion; IFISH

　　J Exp Hematol 2007; 15(2):229-232

　　慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种低度恶性的淋巴细胞增殖性疾病，预后个体差异很大，染色体的异常是影响CLL预后和进展的重要因素。13q14缺失[del(13q14)]是B细胞CLL(BCLL)最常见的染色体异常[1]，单纯del(13q14)预后较好[2，3]。由于大多CLL细胞处于G0期，有丝分裂活性较低，且受丝裂原的种类、浓度和处理时间等影响，故CLL的染色体研究进展缓慢。间期荧光原位杂交(IFISH)技术的应用由于不受细胞分裂的影响，大大促进了CLL遗传学研究的开展[3]。我们运用IFISH技术，采用位于13q14的序列特异性DNA探针D13S319和D13S25，检测24例BCLL中del(13q14)的发生情况。

　　材料和方法

　　一般资料

　　24例CLL患者系2000年10月-2006年2月我院收治的初诊CLL患者，其中男17例，女7例，男女比为2.4∶1;年龄36-84岁，中位年龄57.5岁，60岁以上(包括60岁)11例，60岁以下13例。所有病例诊断和疗效标准参照《血液病诊断及疗效标准》[4]。

　　取肝素抗凝的骨髓标本，经有核细胞计数之后以(1-3)×106的细胞密度接种到2个培养基中，每瓶培养液中加入2% PHA 0.2 ml，标本混匀后置于37℃温箱培养72小时，于中止培养前4小时加入秋水酰胺，终浓度为0.1 μg/ml，经低渗、固定处理后收获细胞;采用R显带法、Giemsa染色，每个样本分析20个中期分裂相。核型描述依据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 2005)》。

　　IFISH

　　探针 采用针对13q14的SpectrumOrangeTM标记的序列特异性DNA探针D13S319和D13S325。探针D13S325远离着丝粒端，探针D13S319位于RB1和D13S325位点之间。两种探针均购自美国Vysis公司，但由于国内这两种商业探针只有SpectrumOrangeTM一种荧光素标记，故未用两种颜色。

　　步骤 ①标本处理：取出于-20℃储存的染色体标本，换用新鲜的甲醇/冰醋酸(3∶1)固定液，气干法滴片，置于37℃ 2 × SSC 中老化30 分钟，在70%、85%、100%室温乙醇中梯度脱水各2分钟。将标本置于72℃变性液(70%甲酰胺/2 × SSC)中变性3 分钟，70%、85%、100%冰乙醇中梯度脱水各2分钟，晾干。②探针处理：每份标本探针0.5 μl，双蒸水1 μl，杂交稀释液3.5 μl混匀，72℃水浴变性5分钟。③杂交：将探针5 μl加于玻片的待杂交区，盖上盖玻片，用Rubber Cement封片后，放于37℃的湿盒内杂交过夜。④洗片：去除盖玻片，将玻片置于72℃的0.4 × SSC/0.3%吐温中2分钟，再置于室温2 × SSC/0.1%吐温中1分钟，取出玻片，晾干。⑤复染：DAPI与2 × SSC体积比1∶1混匀，加6 μl于杂交区，待45分钟后观察结果。

　　检测 用Leica DRMA2型荧光显微镜，在DAPI/SpectrumOrange双色滤光镜激发下观察间期细胞的桔红色荧光杂交信号，每例至少分析200个细胞，计数边界清楚、无重叠、结构完整的细胞核，并用染色体自动分析系统进行图像采集。

　　统计学方法

　　采用χ2检验方法进行差异性检验。

　　结 果

　　正常对照组

　　正常间期细胞用D13S319和D13S25杂交，分别可见到2个桔红色信的杂交信号，有del(13q14)异常的间期细胞则只见到1个桔红色信号(杂合性缺失)或无信号(纯合性缺失)(附图)。对5份染色体核型正常的非血液系统恶性疾病患者外周血淋巴细胞进行del(13q14)异常检测，每个样本分析200个间期细胞，出现1个或无桔红色信号的细胞是del(13q14)假阳性细胞。以阳性细胞数>( +3SD)作为标准，故D13S319和D13S25探针检测del(13q14)的阳性标准分别10%和7.5%。

　　病例组

　　在24例BCLL患者中，用D13S319位点的探针检测，10例患者(41.7%)有13q14的缺失，阳性细胞率为12%-68.4%;用D13S25位点的探针检测，11例(45.8%)存在13q14的缺失，阳性细胞率为8%-79.5%;其中2个位点均存在缺失者为9例(37.5%)。3例患者仅有其中1个位点缺失，其中2例D13S25及D13S319位点缺失的阳性细胞率很接近，分别为8%、3%和6%、12%。另1例2个位点缺失的阳性细胞率差异很大，为0.5%、35.5%。详细资料见表1。

　　24例BCLL患者中对18例进行了常规染色体核型分析(CC)，2例(11.1%)未见分裂相，3例异常(16.7%)。在15例CC正常的患者中，8例存在D13S319位点的缺失，9例见有D13S25位点的缺失，D13S25和D13S319两个位点同时缺失的患者7例。详细资料见表1。

　　24例CLL患者中，9例存在2个位点的共同缺失，3例只有其中1个位点的缺失，共12例存在del(13q14)。7例Binet A期中，4例存在del(13q14)，占57.1% ;7例Binet B期中，3例(42.9%)有del(13q14);10例C期患者中，del(13q14)者5例(50%)。在不同的Binet分期中del(13q14)的阳性率经统计学分析无显著性差异(P>0.05)(表2)。

　　讨 论

　　CLL的白血病细胞有丝分裂低下，CC显带技术仅20%的患者可检测到克隆性染色体异常，加用有丝分裂原刺激剂后近50%的CLL可检测到异常，常见的异常是+12，其次为13号和14号染色体长臂的结构异常[6]。FISH是一种利用非放射性物质标记核酸探针结合荧光素在间期核和中期相上检测特定DNA序列的新技术，既可检测分裂相，也可检测间期细胞，具有快速、准确、敏感等优点。应用FISH，约70%CLL患者可检测到染色体异常[1，7]，其中del(13q14)最常见，其次为del(11q22q23)、+12、del(17p13)和del(6q21)。Dohner等[8]运用IFISH研究325例CLL，结果表明82%的患者具有染色体异常，其中del(13q14)占CLL的55%。Glassman等[3]采用IFISH检测100例BCLL，异常检出率为64%，其中del(13q14)占40%。在本组24例患者中，对18例进行了常规染色体核型分析，11.1%的患者未见分裂相，异常检出率为16.7%，而IFISH检测del(13q14)异常，D13S319探针异常检出率为41.7%，D13S25探针为45.8%，与文献报道相符[3，7，8]。上述结果证明IFISH技术相对于常规染色体分析具有快速、敏感、准确的特点。

　　13q缺失是目前研究最多的染色体结构异常，通常涉及长臂的1区4带，但是缺失长度仍未被确切定义。一些研究表明，缺失区域可能只为13q14，也可能伴有更大片段的缺失。早期研究发现，肿瘤抑制基因——成视网膜母细胞瘤基因(RB1)位于13q14区，del(13q14)可造成该基因的缺失，认为RB1是CLL的候选抑癌基因。以后研究发现，RB1的纯合性缺失很少见，且13q14缺失的断裂点在位于RB1基因远端1.6cM的标记D13S25 的位置，推测del(13q14)的关键基因可能位于RB1基因远端的2个标志D13S25和D13S19之间，约300 ×103 bp的区域内，其突变或缺失，可导致细胞增殖、失去负调控而致肿瘤发生[9]。Liu等[10]使用FISH和Southern blot技术分析13q14最小缺失区位于RB1和D13S25之间。Bullrich等[11]研究发现，缺失片段位于206XF12和D13S25之间约550 kb的范围。Kalachikov等[12]建立了600 × 103 bp范围的物理图谱，并确定一个300 × 103 bp的最小缺失区——D13S272的着丝粒端到D13S272D13S25间隔区的端粒，156例病人中有84例存在这一片段的缺失，这个区域有23个可表达序列，可能与候选基因有关。Corcoran等[13]采用位于13q14的RB1、6E4.5、D13S319、p92c、D13S25等多种探针检测del(13q14)，发现缺失率分别为20%、35%、41%、36%和35%，以D13S319缺失率(41%)最高。在本组试验中，对D13S25和D13S19两个位点的缺失进行检测，D13S325位点远离着丝粒端，而D13S319位于RB1和D13S325位点之间，靠近着丝粒端，发现9例(37.5%)患者同时存在D13S25和D13S19位点缺失，例4及6两种探针的阳性细胞率差异大，可能与与计数的区域、探针D13S25约为160 kb而探针D13S19约为120 kb、计数过程中存在一定的实验误差相关。3例患者仅有其中一个位点缺失，其中2例D13S25及D13S319位点缺失的阳性细胞率很接近，分别为8%、3%和6%、12%，两个位点缺失的不一致性可能与计数的区域相关，存在一定的主观性;另一例患者两个位点缺失的阳性细胞率差异很大，为0.5%、35.5%。综上所述，推测13q可能为D13S25和D13S319之间较大片段的丢失。

　　Dohner等[8]研究结果显示，伴13q异常的CLL患者，中位生存期(MS)133个 月，无治疗生存期(TFS)最长达92个月。单纯13q常于Binet A期时出现，预后同正常核型患者相似。随着研究的深入，发现13q若伴有其它染色体异常，则预后通常不好。Mayr等[14]应用一系列探针对93例BCLL患者进行检测，发现伴有其他易位的13q患者中位TFS明显短于单纯13q患者(41个月vs 132个月)。由于本组研究病例数较少，随访时间短，且未分析13q14缺失是否还伴有其它染色体异常，故在不同的Binet分期中del(13q14)的阳性率经统计学分析无显著性差异(P值>0.05)，del(13q14)的预后价值有待进一步探讨。

　　【参考文献】

　　1徐卫，李建勇，潘金兰等. 60例慢性淋巴细胞白血病的分子遗传学特点. 中华肿瘤杂志, 2006; 28: 349-352

　　2李丽，徐卫，李建勇. 慢性淋巴细胞白血病预后因素研究进展.中华内科杂志, 2006; 45: 781-783

　　3Glassman AB, Hayes KJ. The value of fluorescence in situ hybridization in the diagnosis and prognosis of chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet, 2005;158: 88-91

　　4张之南，沈悌主编. 血液病诊断及疗效标准. 第2版. 北京：科学出版社，1998：228-237

　　5Binet JL, Auquier A, Dighiero G, et al. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer, 1981; 48: 198-206

　　6Juliusson G, Oscier DG, Fitchett M, et al. Prognostic subgroups in Bcell chronic lymphocyte leukemia defined by specific chromosomal abnormalities. N Engl J Med, 1990; 323: 720-724

　　7Goorha S, Glenn MJ, DrozdBorysiuk E, et al. A set of commercially available fluorescent insitu hybridization probes efficiently detects cytogenetic abnormalities in patients with chronic lymphocytic leukemia. Genet Med, 2004; 6: 48-53

　　8Dohner H, Stilgenbauer S, Benner A, et al. Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med, 2000; 343:1910-1916

　　9Stilgenbauer S, Leupolt E, Ohl S, et al. Heterogeneity of deletions involving RBl and the D13S25 locus in Bcell chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res,1995; 55: 3475-3477

　　10Liu Y, Szekely L, Grander D, et al. Chronic lymphocytic leukemia cells with allelic deletions at 13q14 commonly have one intact RB1 gene: evidence for a role of an adjacent locus. Proc Natl Acad Sci USA, 1993;90: 8697-8701

　　11Bullrich F, Veronese ML, Kitada S，et al. Minimal region of loss at 13q14 in Bcell chronic lymphocytic leukemia. Blood,1996; 88: 3109-3155

　　12Kalachikov S, Migliazza A, Cayanis E, et al. Cloning and gene mapping of the chromosome 13q14 region deleted in chronic lymphocytic leukemia. Genomics, 1997;42: 369-377

　　13Corcoran MM, Rasool O, Liu Y, et al. Detailed molecular delineation of 13q14.3 loss in Bcell chronic lymphocytic leukemia. Blood, 1998;91: 1382-1390

　　14Mayr C, Speicher MR, Kofler DM, et al. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood, 2005;105: 2093-2123