以尿苷二磷酸半乳糖为添加剂冷藏兔血小板的研究

　　作者：裴孝平　陈宝安　黄成垠　李翠萍　　　作者单位：东南大学临床医学院，附属中大医院血液科 南京 210009; 江苏省血液中心输血研究二室，南京 210042

　　【摘要】 本研究探讨以尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)为添加剂的血小板冷藏保存方法。采集兔心脏血，按常规方法制备浓缩血小板悬液(PC)，在悬液中添加UDP-Gal，放4℃冰箱储存10天。尔后观察血小板(Plt)数量﹑血小板平均体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)﹑血小板聚集功能(PagT)﹑血小板促凝活性实验(PF3aT和APCT)和血小板凋亡(apoptosis)的变化。将冷藏兔血小板用Cr51标记后，检测输入兔体内后的血小板生存时间。结果表明：加入UDP-Gal冷藏保存10天后的PC的Plt、MPV、PDW、血小板促凝血活性与新鲜PC相比均无显著性变化(P﹥0.05);而冷藏对照PC的Plt明显减少，MPV、PDW显著增大，血小板促凝血活性减低，与新鲜PC相比差异有显著性(P>0.01);加入UDP-Gal的PC冷藏保存10天后的血小板凋亡率与新鲜PC相比有所增高(P﹤0.05)，但明显低于冷藏对照组(P﹤0.01),其血小板聚集率(诱聚剂为阳离子没食子酸丙酯，C-PG)减低，但仍能保持在新鲜血小板的50%以上。添加UDP-Gal时冷藏保存10天的血小板与新鲜的血小板在体内的生存时间相近(P﹥0.05)，输注兔体内72小时时的血小板存活率在新鲜对照组、UDP-Gal冷藏保存组和冷藏对照组分别为57.5%±7.2%、50.3%±6.3%和0.1%±0.5%。结论：尿苷二磷酸半乳糖对冷藏保存的兔血小板有保护作用，并能延长冷藏兔血小板在体内的生存时间。

　　【关键词】 尿苷二磷酸半乳糖;冷藏血小板;血小板

　　Cold Storage of Rabbit Platelet Suspension by Adding Uridine Diphos- phate Galactose　PEI Xiao-Ping,CHEN Bao-An, HUANG Cheng-Yin,LI Cui-Ping,SHI Guang-Yao,XIAO Jian-Yu,GAO Chong,DING Jia-Hua,FEI Fei,WANG Jun,SUN Yun-Yu,CHENG Jian,ZHAO Gang

　　Department of Hematology of Zhongda Hospital, College of Clinical Medcine, Southeast University, Nanjing 210009, China;1Blood Center of Jiangsu Province, Nanjing 210042, China

　　AbstractThis study was aimed to investigate the method to cold-store platelets with uridine diphosphate galactose (UDP-Gal). Rabbit heart blood was prepared for concentrated platelet suspension to which UDP-Gal was added, and then stored for ten days in 4℃ refrigerator. Thereafter, platelet count, mean platelet volume(MPV), platelet distributing width(PDW), platelet aggregation function, platelet activity to urge coagulation including PF3aT and APCT and apoptosis were determined. Meanwhile, survival time in vivo was tested after cold-stored rabbit platelets labeled with Cr51 were transfused into rabbits. The results showed that there was not significant difference for Plt count， MPV， PDW， PF3aT and APCT between UDP-Gal cold-stored platelet group and fresh platelet group (P﹥0.05). On the contrary, platelet count decreased significantly, MPV， PDW jumped and PF3aT and APCT went down in cold control group as compared with fresh platelet group (P﹤0.01). Apoptosis increased in UDP-Gal cold-stored platelet group as compared with fresh platelet group (P﹤0.05), but was significantly lower than that in cold control group (P﹤0.01). Although PagT (inducing reagent:C-PG) decreased, it could still be above 50% of fresh platelet.Survival time in rabbit in vivo was close between UDP-Gal cold-stored platelet group and fresh platelet group (P﹤0.05). Survival rate in seventy-two hours after transfusion in the fresh platelet group, UDP-Gal cold-stored platelet group and cold control group was 57.5%±7.2%, 50.3%±6.3% and 0.1%±0.5 % respectively. It is concluded that the UDP-Gal can well protect cold-stored rabbit platelets and prolong the survival time of cold-stored platelets in vivo.

　　Key words uridine diphosphate galactose; cold stored platelet; platelet

　　目前血小板的保存方法为22℃常温振荡保存。此法保存期短(5天)，22℃条件极有利于细菌生长，易使血小板遭受细菌污染[1]。20多年来，人们一直在探索长期﹑稳定保存血小板的方法。4℃低温保存是维持血液细胞活性的理想方法，然而血小板是很不稳定的细胞，4℃保存的血小板输入体内后的寿命极短，此问题一直困扰着血小板的4℃保存。最近研究发现，血小板经糖基化修饰后再冷藏保存，则可使血小板在体内寿命延长，并且糖基化血小板冷藏后功能完好[2]。尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)是血小板糖基化最好的添加剂，为此我们观察了添加UDP-Gal的兔血小板悬液，在4℃冷藏后的血小板(Plt)数量﹑血小板平均体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)﹑血小板聚集功能(PagT)﹑血小板促凝活性(PF3aT和APCT)和血小板凋亡率的变化，以及输入兔体内后的生存时间。

　　材料和方法

　　仪器与试剂

　　血球计数仪Sysmex公司产品(型号KX-21);LG-PABER血小板聚集凝血因子分析仪为北京世帝仪器公司产品;流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品(型号FACSCalibur);γ-计数器为科大创新股份有限公司中分公司产品(型号GC-911);尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)为Fluka公司产品; 51Cr-铬酸钠(37 MBq/ml,2.57 μg/ml)为Amersham公司产品。

　　实验动物

　　新西兰大白兔9只,体重为2.0-2.4 kg,成年雄性,为江苏省农科院畜牧所实验动物中心提供。

　　混合浓缩血小板样品的制备及实验分组

　　样品的制备将9只新西兰大白兔麻醉后，抽取心脏血18 ml，加入到含有2 ml ACD抗凝剂的无菌塑料试管中，轻轻颠倒混匀，1 100×g轻离心(温度22℃±2℃)5分钟，将上层富含血小板的血浆移入到另1只无菌塑料试管中，再以3 750×g重离心(温度22℃±2℃)6分钟，调血小板浓度为2×1012/L。随机将3只兔子的浓缩血小板悬液混合在一起，制备成1份混合血小板悬液，共制3份混合浓缩血小板悬液样品。

　　实验分组新鲜血小板对照组：取3份新鲜混合浓缩兔血小板悬液(2×1012/L)各2 ml。冷藏血小板对照组：取3份新鲜混合浓缩兔血小板悬液(2×1012/L)各2 ml，放4℃冷藏保存10天。UDP-Gal冷藏血小板组：取3份新鲜混合浓缩兔血小板悬液(2×1012/L)各2 ml，分别添加尿苷二磷酸半乳糖(终浓度为5 g/L)，放4℃冷藏保存10天。分别取0.4 ml血小板悬液测定Plt数量、MPV、PDW和血小板凋亡;取0.6 ml血小板悬液离心去上清后，用新鲜兔血浆调血小板浓度为250×109/L，放37℃水浴2小时后，测定PAgT、APCT、PF3aT;剩下的1 ml血小板悬液用51Cr-铬酸钠标记后，输入兔体内后，测定其生存时间。

　　Plt计数﹑MPV、PDW测定

　　采用血细胞计数仪法。

　　血小板聚集功能的检测

　　实验参照LG-PABER-II仪器操作说明书进行。将已加入250 μl 贫血小板血浆的测试杯放入测试通道中(无测试珠)，按PPP键，测定PPP的OD值，屏幕显示PPP状态。将稀释的血小板悬液(250×109/L)250 μl，加入测试杯中，并加入测试珠，将其放入样品预温通道内预温2分钟，预温时间结束，将该测试杯移入测试通道中，用加样器吸取没食子酸丙酯溶液43 μl,加入相应通道中测试杯的底部，同时按START钮开始检测，最大测定时间为360秒。测试最大血小板聚集百分率。

　　血小板促凝活性实验

　　血小板因子3有效性(PF3aT)测定将血小板聚集仪预热至37℃，在测试杯内，加入稀释的血小板悬液100 μl，预温2分钟，加入200 μl高岭土悬液，37℃保温20分钟后加入25 mmol/L的CaCl2，同时启动秒表测定纤维蛋白析出的时间。

　　活化血浆凝固时间(APCT)测定取浓度为250×109/L的兔血小板悬液100 μl，加终浓度为300 μmol/L的阳离子没食子酸丙酯溶液12 μl，混匀，37℃孵育180秒后，加入20 mmol/L的氯化钙溶液100 μl后，记录血浆凝固时间。

　　血小板凋亡率的检测

　　采用Annexin V 结合分析法，根据试剂盒操作说明，将含CaCl2的buffer 500 μl加入血小板悬液50 μl中混匀，吸出50 μl加Annexin V-FITC 5 μl 室温避光反应 15 分钟后上机检测。

　　血小板标记及生存时间的检测

　　取2×1012/L的血小板悬液1 ml, 3 750× g重离心6分钟,弃上清液,下层血小板沉淀加生理盐水1 ml,使血小板混悬,加0.56 MBq的51Cr-铬酸钠,37℃孵育45分钟,其间振荡数次,以3 750 ×g重离心6分钟,弃上清液,加2 ml生理盐水混悬血小板。将混悬血小板经耳缘静脉输入兔体内,分别在输入1、24、48、72小时时抽取兔耳中央动脉血1 ml，用γ-计数器测定其放射性(cpm),以1小时的放射性为100%，计算血小板存活百分率。

　　统计学处理

　　用SPSS 10.0统计软件进行结果统计分析，实验数据用均数标准差(X±SD)表示，两样本均数比较采用配对t检验。

　　结果

　　添加UDP-Gal的兔血小板悬液冷藏保存后的Plt、PDW、MPV的变化

　　添加尿苷二磷酸半乳糖的兔血小板悬液冷藏保存10天时的Plt计数、PDW、MPV与新鲜血小板相比均无明显变化(P>0.05)。新鲜血小板对照组、UDP-Gal冷藏血小板组和冷藏血小板对照组的Plt、PDW、MPV分别为(1 982±10)×109/L、(6.50±0.26)fl、(5.52±0.21)fl，(1 952±12)×109/L、(6.39±0.52)fl﹑(5.79±0.30)fl和(1 182±23)×109/L﹑(18.33±0.35)fl﹑(11.70±0.44)fl。这一结果表明，冷藏血小板对照组的Plt数明显减低，PDW和MPV均明显增大(P<0.01)。

　　添加UDP-Gal的兔血小板冷藏保存后的聚集功能及促凝活性的变化

　　添加尿苷二磷酸半乳糖的兔血小板悬液冷藏保存10天的血小板的聚集功能与新鲜血小板相比明显降低，但聚集功能仍能保持在新鲜血小板的50%以上;其血小板促凝活性与新鲜血小板相比亦无明显改变(P﹥0.05);而未添加尿苷二磷酸半乳糖的冷藏血小板的血小板的聚集功能几乎完全丧失，血小板促凝活性亦明显减弱，与新鲜血小板相比，P﹤0.01。新鲜血小板对照组、UDP-Gal冷藏血小板组和冷藏血小板对照组的PAgT分别为(35.23±2.56)%、(19.42±4.41)%、(2.27±1.39)%。APCT分别为(27.40±3.25)秒、(29.79±2.57)s、(35.70±0.46)秒;PF3aT分别为(27.67±1.53)秒、(29.00±1.21)秒、(34.33±1.15)秒。

　　添加UDP-Gal的兔血小板冷藏保存后的血小板凋亡变化

　　加入UDP-Gal的血小板悬液冷藏保存10天后的血小板凋亡率与新鲜血小板悬液相比有所增高(P﹤0.05)，但明显低于冷藏对照组(P﹤0.01)，血小板凋亡率在新鲜血小板对照组、UDP-Gal冷藏血小板组和冷藏血小板对照组分别为(5.22±1.01)%、(18.63±1.24)%和(41.07±1.22)%。

　　添加UDP-Gal的兔血小板冷藏保存后的血小板体内生存时间的变化

　　未加入UDP-Gal的4℃冷藏保存的兔血小板输入兔体内后很快被清出血流，而加入UDP-Gal的血小板悬液冷藏保存的兔血小板在兔体内的生存时间则明显延长。添加UDP-Gal的血小板悬液，于4℃冷藏保存10天，然后输入兔体内，在各时间点的血小板存活率与新鲜血小板相比无统计学差异(P值均>0.05);而UDP-Gal冷藏血小板组和新鲜血小板对照组在各时间点的存活率均高于冷藏血小板对照组(P<0.01)。新鲜血小板对照组、UDP-Gal冷藏血小板组和冷藏血小板对照组在输注24、48、72小时时的血小板存活率分别为78.1%±7.9%、65.4%±6.7%、57.5%±7.2%;71.2%±7.7%、67.4%±8.0%、50.3%±6.3%和2.5%±1.3%、0.8%±1.4%、0.1%±0.5%(附图)。

　　讨论

　　血小板在常温22℃±2℃连续振荡条件下保存极有利于细菌生长，易使血小板遭受细菌污染。解决这一问题最好办法就是降低血小板的存储温度，但当存储温度﹤20℃时，就会导致血小板的低温活化，回输到体内后，很快被清出血流，止血功能下降。动物试验表明，表达Mac-1并且无Mac-1缺陷的小鼠暴露在4℃环境中2小时后，血小板数量快速下降[3-6]。这种血小板的清除主要是防止活化的血小板所致的病理性血栓形成，是动物在进化过程中的一种自我保护机制。将冷藏保存的小鼠血小板输入Mac-1缺乏的小鼠体内，其寿命及止血的功能均正常。Hoffmeister等[2，7]研究表明，肝脏巨噬细胞表面的Mac-1受体识别血小板膜上糖蛋白GPIb，并能与之结合，在正常条件下GPIb在膜上呈散在分布，故与Mac-1受体亲合力低，当血小板低温激活后，引起血小板膜侧向分离，使GPIba呈簇状聚集，从而与Mac-1的亲合力增强，导致血小板被巨噬细胞吞噬破坏。Mac-1是一种凝集素，它的识别位点是血小板膜上暴露的GPIbaN-链聚糖的-N-乙酰葡萄糖氨基残基(β-N-GLCNAC)，β-N-GLCNAC糖基化可有效地封闭Mac-1的识别位点，保护血小板免受肝脏巨噬细胞的清除。由于β-N-GLCNAC所在的氨基位远离vWF的结合位点，故β-N-GLCNAC半乳糖化并不影响血小板的黏附和聚集功能。本实验将尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)添加到浓缩兔血小板悬液中，冷藏保存10天后发现，UDP-Gal对冷藏兔血小板有明显保护作用，冷藏保存后血小板的数量、促凝活性﹑体内生存时间均与新鲜血小板接近。尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)在半乳糖转移酶(GalT)的作用下，能有效地使β-N-GLCNAC半乳糖化。GalT存在于血小板膜上，在浓缩血小板悬液中直接加入UDP-Gal，而无需添加GalT。尿苷二磷酸半乳糖是机体物质代谢过程中的一个中间体，人体内源性的半乳糖每日生成量约2 g，对机体无任何毒副作用。我们的实验表明，将10 mg UDP-Gal输入2.5-3.0 kg的兔体内，兔无异常反应。温度对β-N-GLCNAC的半乳糖化影响不大，我们在浓缩血小板悬液中加入UDP-Gal，37℃作用60分钟，冷藏保存，与加入UDP-Gal直接冷藏保存血小板悬液相比，其输入兔体内的血小板生存时间无明显差异，故在浓缩血小板悬液中加入UDP-Gal后即可直接冷藏保存。

　　【参考文献】

　　1 Lee CK, Ho PL, Lee KY, et al. Estimation of bacterial risk in extending the shelf life of PLT concentrates from 5 to 7 days. Tansfusion, 2003; 43:1047-1452

　　2 Hoffmeister KM, Josefsson EC, Isaac NA, et al. Glycosylation restores survival of chilled blood platelets. Science, 2003; 301(5639): 1531-1534

　　3 Andrews PK,Berndt MC. Platelet physiology in cold blood. Curr Bio, 2003;13:282-284

　　4 Hoffmeister KM, Feibinger TW, Falet H, et al. The clearance machanism of chilled blood platelets. Cell, 2003;112:87-97

　　5 Simon DI, Chen Z, Xu H, et al. Platelet glycoprotein Ibα is a counterreceptor for the leukocyte integrin Mac-1 (cdIIb/CD18). J Exp Med, 2000; 192: 193-204

　　6 Hoffmeister KM, Josefsson EC, Wangner DD, et al. Machanism,significance and repair of cold-mediated platelet clearance. Blood, 2002;100:707a

　　7 Hoffmeister KM, Babic AM, Kaufman RM, et al. Glycosylation enables prolonged survival of chilled platelets in mice. Blood, 2003; 102: 93a