血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS-13)研究进展△

　　作者：赵星　　作者单位：中南大学湘雅二医院老年病学科， 长沙 410011

　　【关键词】 血管性血友病因子裂解酶; 血栓形成 ; 炎症

　　近年研究表明：血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS-13)对血栓形成有重要作用。ADAMTS-13最初是在对血栓性血小板减少性紫癜[ 6][10](TTP)的研究中发现。TTP是一种罕见的微血管病变，特征表现有溶血性贫血，血栓形成，肾功能衰竭与发热，而通过对家族及遗传性TTP的研究发现：在急性TTP患者体内缺少足量的ADAMTS13，在TTP患者体内也发现了抑制ADAMTS-13的自身抗体，而在儿童中发病的溶血尿素综合征同样有ADAMTS-13的缺乏，因此发现这类疾病与ADAMTS-13的缺乏和抑制有关。随着对TTP的深入认识，目前已从正常人血浆中提纯出一种特定的大分子量，能被金属离子钙和钡所激活的ADAMTS-13。

　　1 ADAMTS-13的基础研究

　　1.1 分离纯化 Barbara Plaimauer[1]在HEK293细胞中完整的克隆了ADAMTS-13的cDNA序列，重组的ADAMTS-13与血浆中的ADAMTS13一致。Levy Soejima 等用Northern印迹法在肝脏内发现了ADAMTS-13，因此认定肝脏是ADAMTS-13的合成部位，而Plaimauer[11] 发现ADAMTS-13不局限于肝脏，心脏，脑，肾等器官也可以合成ADAMTS-13，尽管量较少，研究还发现重组的ADAMTS-13对vWF的降解作用可被TTP患者血浆中以及合成的IgG抗体所抑制，充分说明TTP患者血浆中存在抑制ADAMTS-13的抗体.另外ADAMTS-13的合成受雌激素的影响较大.

　　1.2 生物结构及生物学活性[2] [3] 人的ADAMTS-13基因位于9号染色体长臂，全长37kb，由29个外显子组成，开放阅读框为4284bp,由1427个氨基酸残基组成并含有一个信号肽，一个含有41个氨基酸残基的短前肽，一个reprolysin样金属酶结构域，一个disintegrin样结构域，一个凝血酶敏感蛋白酶-1重复序列，一个富含半胱氨酸结构域，一个ADAMTS间隔区，七个附加的凝血酶敏感蛋白-1重复序列，两个CUB结构域。在pH值为8～9且有一定剪切力作用于受试血浆时，在低离子强度物质尿素和胍的参与下，vWF超大型多聚体由纱织球状展开为丝状，842位酪氨酸残基和843位蛋氨酸残基间的裂解部位暴露，从而被ADAMTS-13裂解产生分子量为140Kda和176Kda的两个片段。这种裂解作用可被EDTA 和EGTA所抑制。不同物质对ADAMTS-13活性影响不同。螯合剂可强烈抑制此酶的活性，N乙基马来酰亚胺的抑制作用较慢。在人体内可以找到同样的裂解片断证明酶在正常人血浆中也有作用。

　　1.3 系统性抗凝作用 Anlik chauhan等[4] 通过显微镜比较观察在灌注A23187之后ADAMTS-13-/-小鼠及ADAMTS-13+/+小鼠血管内血栓形成发现ADAMTS-13+/+小鼠血管内只有少量血小板聚集，但无血栓形成，而ADAMTS-13-/-小鼠血管内有血栓形成且持续45s到2min，而相同条件下分别注入ADAMTS-13抗体ADAMTS-13+/+小鼠和ADAMTS-13-/-小鼠血管内均可见更多的血小板粘附，但ADAMTS-13+/+小鼠血小板链长度明显短于ADAMTS-13-/-小鼠，灌注ADAMTS-13拮抗剂，ADAMTS-13 -/-小鼠仍有微血栓形成，ADAMTS-13+/+小鼠血管内只有血小板与内皮细胞粘附，无微血栓形成。ADAMTS-13对血小板黏附与内皮细胞及内皮细胞下均有负向调节作用，ADAMTS-13可以延缓血栓形成，可以调节血小板间的相互作用，清除血小板链，缺乏ADAMTS-13时，炎症，变态反应甚至血小板活化都会诱发TTP。

　　2 ADAMTS-13的临床研究

　　2.1 血栓性微血管病 血栓性微血管病 [5][6][7][8]是一类以全身性或肾内血小板聚集，减少以及红细胞机械受损为特征的微血管阻塞性疾病，包括TTP和溶血尿素综合征两种疾病。ADAMTS-13的发现及其特征的研究有利于我们明确TTP的发病机制，超大型vWF多聚体能在血流剪切力作用下诱导血小板聚集。家族性血栓性血小板减少性紫癜的发病主要是ADAMTS-13基因缺陷影响蛋白酶活性，使血浆中超大型vWF多聚体不能降解，导致微循环血小板聚集和粘附，形成微血栓引起发病。在ADAMTS-13被确定之前，人们发现血浆置换可以有效治疗大多数TTP患者，但机制一直不明。在明确了ADAMTS-13缺陷与TTP发病关系之后，为血浆置换治疗该疾病提供的有力的证据。同时，通过监测血浆中ADAMTS-13活性还可以了解疗效。获得性TTP患者血浆中存在ADAMTS-13自身抗体，所以在应用血浆治疗同时，联合免疫抑制剂如肾上腺皮质类固醇激素，长春新碱或脾切除等，将会有助于对血浆置换产生抵抗的患者的治疗。ADAMTS-13的活性降低还与血管性血友病2A型有关。

　　2.2 弥漫性血管内凝血(DIC)Tomoko Ono 等[12]分析了DIC继发的严重ADAMTS-13缺乏患者的临床及实验室数据发现ADAMTS-13活性低于20%患者血清肌酐水平显著高于ADAMTS-13活性高于20%患者，ADAMTS-13活性低于20%患者的肾功能受损显著高于ADAMTS-13活性高于20%患者，DIC的病因有很多，包括脓肿，恶性肿瘤，严重的组织损伤以及妊娠相关疾病，而微血栓被认为是DIC的病理基础之一，在DIC病程中各种细胞因子被激活，大量证据显示vWF蛋白水解酶也在其列，但由于血制品(血小板，冰冻血浆)中都可能含有ADAMTS-13，所以血液中测得的ADAMTS-13不能准确反映ADAMTS-13的缺乏程度。DIC患者ADAMTS-13缺乏可能导致血小板聚集，激活组织因子，诱发器官衰竭，大量超大型vWF多聚体的出现以及ADAMTS-13的缺乏与血清肌酐水平相关，提示严重的继发性ADAMTS-13的缺乏可能与肾功能衰竭有关， Tomoko Ono 的研究还发现plasmin以及可能是ADAMTS-13的裂解酶，这种裂解酶及其抑制物与ADAMTS-13之间保持着一种平衡，DIC患者体内这种平衡的打破导致ADAMTS-13数量的减少或者活性降低，导致大量超大型vWF多聚体的出现，血小板活化，血栓形成。

　　2.3 心血管疾病 Masakazu Matsukuwa[13][14] 等报道了急性心肌梗死(AMI)病程中血浆ADAMTS-13水平的一系列变化; AMI患者血浆vWF水平显著高于对照组，而ADAMTS-13水平显著低于对照组，ADAMTS-13水平在入院后3天内急剧下降而后又缓慢回升，vWF/ADAMTS-13可以作为血栓事件的定量检测方法，AMI患者vWF/ADAMTS-13显著高于对照组。而在对AMI后1年的随访中发现92个患者中有13患者再发血栓事件，其中亚急性血栓4例，脑栓塞2例，缺血性心肌病1例，COX风险分析显示：高vWF，高vWF/ADAMTS-13，低ADAMTS-13对血栓有预测意义，Kaplan—Meier分析显示：低水平ADAMTS-13及高vWF/ADAMTS-13患者在未来一年内更容易再发血栓事件说明高vWF/ADAMTS-13是AMI后一年再发血栓事件的预测因素之一。这一试验的具体解释包括AMI发病初期大量ADAMTS-13用于分解超大型vWF多聚体，另一种解释可能是血栓及其调节因子导致的ADAMTS-13的水解。该研究还发现血浆中vWF及ADAMTS-13在AMI后14d内没有降到正常。早期vWF的增高被视为急性冠脉综合征预后不良的危险因素，但vWF/ADAMTS-13是 否与原发AMI有关以及AMI发病3天内这一比例的增高是否导致了随访一年内的血栓事件，尚需进一步的大样本临床试验。Van den Born报道不稳定型心绞痛患者ADAMTS-13显著低于稳定型心绞痛患者，而恶性高血压患者ADAMTS-13水平低于正常。

　　2.4 肝脏疾病 肝静脉阻塞是造血干细胞移植后的一种严重的并发症。检测患者移植后血浆vWF抗原，vWF多聚体及ADAMTS-13活性水平显示ADAMTS-13活性下降可以作为预示肝静脉阻塞发生的一个极其有用的指标。肝脏是合成ADAMTS-13的主要器官,肝硬化，肝炎等疾病时均有该酶的活性降低。

　　2.5 自身免疫疾病 ADAMTS-13不仅是一种基因突变，它的缺乏和功能缺陷与自身IgG抗体也有密切联系，诱导抗体产生的原因包括药物，妊娠，肿瘤以及感染，自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮，系统性硬化，抗磷质综合征等)与ADAMTS-13的缺乏也有关系，Mannucci P [15] 又比较123患者(其中36名患者为系统性红斑狼疮患者，87名患者为系统性硬化患者，14名患者无上述疾病但ADAMTS-13低于40%)并寻找抗ADAMTS-13抗体，发现系统性红斑狼疮患者ADAMTS-13水平显著低于对照组，vWF：Ag水平显著高于对照组，在经过治疗和未经过治疗的患者中都发现ADAMTS-13水平降低，从而排除了免疫抑制剂对实验结果的影响。 Austin [16]发现严重的抗磷脂综合征患者可观测到与TTP相似的微血栓形成，提示两者间有共同的病理生理基础。

　　2.6 肿瘤 Mannucci P[17]等通过比较20个弥散肿瘤患者于15个成人局部肿瘤患者发现弥散肿瘤患者血浆中ADAMTS-13的水平极低甚至测不到(小于15%)而局部肿瘤患者体内尽管出现了vWF超大型多聚体，但ADAMTS-13活性仍属正常。通过对观察49位肿瘤患者(其中21位患者属弥散肿瘤患者20人属局部肿瘤患者)以及正常人的对照组发现：无论弥散肿瘤患者还是局部肿瘤患者的ADAMTS-13水平显著低于对照组，弥散肿瘤患者ADAMTS-13水平低于局部肿瘤患者，但无统计学意义。肿瘤患者vWF：Ag水平显著高于对照组。vWF：Ag是水平与ADAMTS-13活性为负相关。与 Oleksowicz 不同的是 Mannucci P发现即使局限肿瘤患者也有ADAMTS-13活性降低。当然不能排除肿瘤侵犯肝脏等合成器官导致ADAMTS-13活性降低。

　　2.7 炎症相关疾病 近年来临床研究在诸如弥漫性血管内凝血，全身炎症反应综合征，急性呼吸窘迫综合征这些疾病[18] [19]时发现炎症疾病有相关凝血系统的改变，炎症细胞因子与凝血系统联系甚密。炎症细胞因子和凝血因子都有许多共同活化途径，炎症因子和抗凝系统间也有密切联系，炎症细胞因子对纤溶系统也有调节作用。在这些研究中血小板被认为是在炎症系统和凝血系统间的桥梁，而Clemensl Bockmeyer等发现系统性炎症导致ADAMTS-13的减少，ADAMTS-13，vWF的不平衡与炎症程度相关，比较了心脏术后器官衰竭高危患者与低危患者和感染性休克患者发现：ADAMTS-13在心脏术后器官衰竭高危患者组及感染性休克患者组低于40%,感染性休克患者组死亡病人ADAMTS-13显著低于存活病人,而LI-6显著增高，存活病人中ADAMTS-13显著增高，LI-6显著降低，随着器官功能衰竭加重，ADAMTS-13逐渐降低，超大型vWF多聚体逐渐增多。低ADAMTS-13活性与DIC严重程度有关，ADAMTS-13活性的降低以及超大型vWF多聚体的出现都活化了血小板，激活了凝血系统，ADAMTS-13的活性降低与炎症的发生发展都有关系，而ADAMTS-13的具体作用机制尚待研究。是否可以从ADAMTS-13切入。研究炎症与血栓的关系，也有待于进一步的大量临床研究。

　　从这些研究可以得出结论：ADAMTS-13活性的降低不仅是溶血尿素综合征，TTP的重要特征，而且与炎症相关疾病，肝脏疾病，肾功能衰竭，结缔组织病，AMI后再发血栓等疾病的发生发展都相关。这些疾病的共同特征是都涉及终末血管，血管内皮改变，血小板活化，都与血栓形成有关，尤其是ADAMTS-13在炎症疾病与血栓疾病之间架起桥梁，为更深一步研究两种疾病的联系提供了重要的切入点。

　　【参考文献】

　　[1] UEMURA M ,TATSUMI K, MATSUMOTO M, et al..Localization of ADAMTS13 to the stellate cells of human liver[J].Blood ，2005， 106:922924。

　　[2] ZHENG X,CHUNG D,Takayamall T,Majerus EM,Sadler JE.Structure of von Willebrand factorcleaving protease ,a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura[J]. The Journal of Biological Chemistry，2001， 276:4105941063。

　　[3] MANNUCCI P,PEYVANDI F. TTP and ADAMTS13:When Is Testing Appropriate [J]?Hematology，2007， 121126

　　[4] ANIL K. C, DAVID G. M,COLIN B. L。Wolfgang Bergmeier,Michael Dockal. Systemic antithrombotic effects of ADAMTS13 [J].JEM，2006，203:767776。

　　[5] SHENKMAN B.The role of ADAMT13 in platelet adhesion in flow: methods for diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura[J]. Pathophysiol Haemost Thromb，2006，35(12):98102.

　　[6] KOBAYASHI T,WADA H,KAMIKURA Y, et al。Decreased ADAMTS13 activity in plasma from patients with thrombotic thrombocytopenic purpura[J]. Thromb Res，2007，19(4):447452.

　　[7] BANNO F,KOKAME K.ADAMTS13 is a metalloprotease that regulates platelet aggregation in hemostasis[J]. Seikagaku，2006，78(6):528532.

　　[8] ARDALAN M R. Review of thrombotic microangiopathy (TMA), and postrenal transplant TMA[J]. Saudi J Kidney Dis Transpl， 2006 ，17(2):235244.

　　[9] ZIMMERHACKL LB,SCHEIRING J,Prufer F.Renal transplantation in HUS patients with disorders of complement regulation[J]. Pediatr Nephrol，2007 ，22(1):1016.

　　[10] SADLER J E.Thrombotic thrombocytopenic purpura: a moving target[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program，2006，41520.

　　[11] PLAIMAUER B, FUHRMANN J, MOHR G, et al. Modulation of ADAMTS13 secretion and specific activity by a combination of common amino acid polymorphisms and a missense mutation[J].Blood，2006，107:118125。

　　[12] ONO T, MIMURO J, MADOIWA S, et al. Severe secondary deficiency of von Willebrand factor–cleaving protease (ADAMTS13) in patients with sepsisinduced disseminated intravascular coagulation: its correlation with development of renal failure[J].Blood，2006，107:528534。

　　[13] MATSUKAWA M ,KAIKITA K, SOEJIMA K, F et al. Serial change in von Willebrand Factorcleaving Protease (ADAMTS13)and Prognosis After Acute Myocardial Infraction[J].Am J Cardiol， 2007，100:758763。

　　[14] CHION CK,DOGGEN CJ,CRAWLEY JT,et al.ADAMTS13 and von Willebrand factor and the risk of myocardial infarction in men[J]. Blood， 2007 ，109(5):19982000.

　　[15] MANNUCCI P,VANOLI M,FORZA L, et al。 von Willebrand Factorcleaving Protease (ADAMTS13)in 123 patients with connective tissue diseases(systemic lupus erythematosus and systemic sclerosis) [J].Haematologica， 2003，88:914918。

　　[16] AUSTIN SK,STARKE RD,LAWRIE AS et al.The vWF/ADAMTS13 axis in the antiphospholipid syndrome: ADAMTS13 antibody and ADAMTS13dysfunction[J].Br J Haematol，2008 141(4):536544。

　　[17] MANNUCCI P,KARIMI M,MOSALAEI A, et al。, Patients with localized and disseminated tumors have reduced but measurable levels of ADAMTS13(von Willebrand Factorcleaving Protease) [J].Hemostasis ，2003，88:454458。

　　[18] NGUYEN TC,LIU A,LIU L, et al。.Acquired ADAMTS13 deficiency in pediatric patients with severe sepsis[J]. Haematologica， 2007， 92:121124。

　　[19] BONGERS TN, MAAT MP, GOOR ML, et al。.High von Willebrand factor levels increase the risk of first ischemic stroke: influence of ADAMTS13, inflammation, and genetic variability[J]. Stroke， 2006 ，37(11):26722677.