新疆地区动脉血栓形成患者抗活化蛋白C及FⅤ Leiden 突变

　　作者：高丽霞,哈力达•亚森,许风雷,王学锋　　作者单位：1.新疆医科大学 第一附属医院血液科，克拉玛依830054 2.新疆克拉玛依市 中心医院神经内科, 克拉玛依830054 3.上海交通大学医学院附属瑞金医院 上海血液学研究所，上海200025

 　　【摘要】目的研究抗活化蛋白C(activated protein C resistance,APCR)现象和FⅤ Leiden在新疆正常人群、血栓患者中的发生情况。方法 对414例正常体检者(N)和79例脑梗死患者组(CT)及46例心肌梗死患者组(MI),用APCR法进行APCR敏感比(nAPCSR)(<0.68)和APCR 阳性率(<2.0为阳性)测定,用多聚酶链反应-限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP)分析及DNA 序列分析对以上标本APCR 阳性者做 FⅤ Leiden 突变和凝血酶原G20210A位基因突变的检测的分析。结果 APCR 发生率正常对照组为6.28 %,其 APCR 发生率在哈萨克族、维吾尔族、回族、汉族中分别是12%、8.4%、8.35%及4.8%,正常人APCR 发生率在哈萨克族较高,且各少数名族与汉族APCR发生率差异有统计学意义(P<0.05)。脑梗死病例组的APCR发生率为11.39 %,心肌梗死病例组的APCR发生率为8.70 %;两组间以及两组APCR发生率分别与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。各组人群中均未检出 FⅤ Leiden 1691G→A突变杂合子以及凝血酶原G20210A位基因突变。结论 APCR 现象在新疆地区正常人少数民族中有较高的发生率，其分布与人种、地域有关。未检出FⅤ Leiden，和凝血酶原G20210A 位突变。因此，FⅤ Leiden突变不是新疆地区人群动脉血栓发病的主要危险因素。

　　【关键词】 动脉血栓; 抗活化的蛋白C; 凝血因子Ⅴ基因突变

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 脑梗死患者组:本院2005 年10月～2006年4月神经内科住院患者 79例(男48，女31)，年龄15～81(60.69±12.71)岁，根据临床病史，神经系统体检，诊断符合全国第四次脑血管病学术会议诊断标准, 并经头颅CT 或核磁共振确诊。心肌梗死患者组：本院同期急诊内科，CCU 住院患者46例(男35 ，女11 )， 年龄36～81(64.30±11.91)岁，根据临床病史，心电图检查和心肌酶谱检查结果，符合全国第二次心血管病学术会议诊断标准(1986年),近期(1个月内)无严重感染史、手术史和外伤史，无服用抗血小板药、抗凝药史 。正常对照组：本院体检者414 例(男197例,女217)，年龄17～74(46.48±15.92 )岁,经体检无血栓性疾病症状和体征，无心、肝、肾病史,近期未服药,各项体检指标正常。

　　1.2 调查方法

　　1.21 按事先设计好的临床资料表格，经专人进行询问填写。包括一般项目：姓名、年龄、性别、民族以及原发病、合并症等。

　　1.22 标本处理 病例组和健康对照组均于晨6～8 h空腹静脉血，用0.129 mmol/ L 的柠檬酸三抗凝剂，抗凝剂与血液之比为1∶9，采血或充分混匀，然后在4℃下3 000 r/ min 离心15 min，(采血前1周停用对凝血和止血有影响的药物) 吸取贫血小板血浆,分别将剩余血细胞置于- 70 ℃冰箱贮存备用。

　　1.3 抗APC 敏感性比值(APCSR)的检测 按Dahlback[1]以活化部分凝血活酶时间(aPTT)为基础检测APCR , 应在严格标准化的试验条件下进行，用 Coatest APCR试剂(Chromogenix , Sweden) 在Sysmex AC7000 (日本)血液凝固仪上检测，即用50 μl 的待检血浆与等量的aPTT试剂， 分别测得加和不加活化蛋白C(APC) 的aPTT，重复上述试验取其均值，并计算加入APC 前后之APCSR。计算正常化APCR 敏感性比率(nAPCRSR) ,即nAPCRSR = 被检者APCRSR/ 正常混合血浆APCRSR。

　　1.4 因子 FⅤ Leiden 分析 按Bertina[2]等的方法。多聚酶链反应扩增凝血因子第10 外显子片断，再用限制性内切酶 MnLI (Biolabs)消化，2% 琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外灯下观察结果。仪器:PCR 热循环仪( PE480)、电泳仪、电泳装置、紫外检测仪。试剂:细胞膜裂解液、细胞核裂解液(pH 8.2)、10×PCR 缓冲10×酶解缓冲液 buffer2、TE 缓冲液、Tag DNA 聚合酶、dNTPs、Marker以及引物购自上海申能博彩公司，限制性核酸内切酶 MnlⅠ购自生工公司，蛋白酶E购自Sigma公司。用以扩增正常或突变等位基因的序列特异性引物如下表。扩增片断为 267 bp。

　　表1 FⅤ基因检测聚合酶链式反应序列APC裂FⅤ肽键位点 FⅤ外显子 引物序列Arg 306 The 7 5’TCT TGC CTT TTC TGG ATG C3’ 519bp BstNⅠArg 306 Gly 5’TTT GGT GAT TTG GGG GTA A3’ MspⅠArg 506 Gln 10 5’ATT GGT TCC AGC GAA AGC3’ 386bp MnIⅠ 5’CCA TTAT TTA GCC AGG AGA CC3’

　　1.5 凝血酶原基因 G20210A 的检测 根据Poort[3]的方法，用聚合酶链反应(PCR),扩增含有PT基因 G20210A 变异的DNA片断，上游引物5’TCT AGA AAC AGT TGC CTG GC3’(1988919908),下游引物为5’ATA GCA CTG GGA TTG AAG C3’(2023320212)。PCR产物纯化后，加入Hilld Ⅲ 内切酶酶切，消化片断在1%琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色后，紫外灯下观察结果。

　　1.6 统计学处理 采用SPSS 12.0统计学软件上机分析。计量资料正态分布以均数±标准差(x±s)描述 ，多个组间比较用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。定性检测指标以阳性率(%)表示。

　　2 结 果

　　2.1 一般检查项目的比较 3组的 aPTT 的检测值比较无差别，脑梗死组的aPTT 1(加入APC的aPTT值)与正常人组比较高，差异有统计学意义(P=0.001)。表2 脑梗塞组和心肌梗死组与正常人组APCR 等一般项目的比较

　　2.2 参考Seven sson等的评定标准 [4] , 正常人nAPCR的5%。百分位数为0.68, 以0.68 为临界值, 414 例正常人nAPCSR发现26 例低于此值, 占正常人总数的6.28%。男女间发生率无差别;79 例脑梗死病例组中APCR发生率为11.39 %; 46例心肌梗死病例组中APCR 发生率为8.7 %，男性显著高于女性。 3组 APCR 发生率做两两比较，差异均呈显著性 (P<0.05)。

　　表3 病例组和对照组APCR的阳性率组 别 例数 阳性数 阳性率(%)正常组 414 26 6.28%*男 197 10 5.08%女 217 16 7.37%脑梗组 79 9 11.39%*男 48 6 12.50%女 31 3 9.68%心梗组 46 4 8.70%*男 35 4 11.4%女 11 0 0.00% 注：*表示P<0.05(两病例组分别与对照组及两病例组间比较)

　　2.3 表3 对照组中各民族组间，哈萨克族、维吾尔族、回族及汉族的APCR发生率分别为12.00%、8.40%、8.31%、4.82%。各少数民族的APCR 均显著高于汉族(P<0.05)，其中哈萨克族组是汉族的2.5倍。脑梗死病例组中哈萨克族、维吾尔族的APCR发生率分别为30.0%、25.0%，均显著高于汉族(P<0.05)，是汉族APCR(8.2%)的3.7和3.1倍。心肌梗死病例组 维吾尔族的APCR发生率(8.33%)和汉族的APCR发生率(9.09%)无明显差别。

　　表4 不同民族间APCR阳性率的比较民 族 对照组 脑梗死组 心肌梗死组哈萨克族 12.00%(3/25)* 30.0%(1/3)*维吾尔族 8.40%(9/107)* 25.0%(3/12 )* 8.33%(1/12)回 族 8.31%(1/12)* 0.0%(0/3) 0.00%(0/1)少数民族总数之和 9.00%(13/144)* 2.2%(4/18)* 7.60% (1/13)汉 族 4.82%(13/270) 8.2%(5/61) 9.09%(3/33) 注：*表示P<0.05 (两病例组分别与对照组及两病例组间比较)

　　2.4 进一步按年龄<45岁为界限 对三组的APCR阳性比较, 只有<45岁做组间的比较，脑梗死组APCR阳性率高于正常人组APCR阳性率，差异有统计学意义(χ2=7.748，P=0.047)，而其他的组间组内比较均无差别。

　　2.5 除了在回族男性的APCR比值外，正常人的APCR比值在新疆少数民族中明显低于汉族人，其中哈萨克族的APCR比值较低。哈萨克族、维吾尔族及少数民族的APCR比值低于汉族，差别有统计学意义(P=0.0298，P=0.0158，P=00019);除了在哈萨克族的APCR比值外，其余各组男性均高于女性(P<0.05)。表5 正常人各民族APCR比值的比较组别 哈萨克族 维吾尔族 回族 少数民族和 汉族男 2.55±0.23 2.71±0.54 3.22±0.36 2.72±0.37 2.96±0.63女 2.56±0.59 2.52±0.46 2.34±0.63 2.52±0.56 2.71±0.55合计 2.56±0.49* 2.67±0.51* 2.63±0.68* 2.63±0.56** 2.83±0.60 注:与汉族比较，各组均*表示P<0.05**表示P<0.01

　　2.6 FⅤLeiden突变的检测结果 对APCR阳性的标本经PCRRFLP检测后,未见FⅤLeiden突变。(先以 Fv7 BstN I,再用Fv7 Msp I 酶切后，都没有切开, 后用FVL酶切后。)

　　2.7 凝血酶原G20210A 位突变基因结果在没有20210 位点突变时,PCR 产物序列为5’CTC AGC GAG CTT CA 3’,如果发生20210G→A 突变, 则PCR产物序列为5’CTC AGC AAG CTT CAA 3’( 加粗者为20 210 位核苷酸) ;其中“A ↓AGCTT”HindⅢ酶切位点。结果显示,所有标本的酶解产物与345 bp片段大小相符,即没有发现凝血酶原基因20210G→A。

　　3 讨 论

　　3.1 血栓性疾病是当前危害人类健康，导致患者死亡的主要原因之一。血栓性疾病的发病机理较为复杂，迄今尚未完全阐明。APCR现象是欧美等国导致静脉血栓形成的重要原因,在血栓病患者中高达40 %[5] 。有研究[6]认为在脑卒中和心肌梗死患者APCR发生率分别可达20 %和9 %。和国外相比,国内APCR发生率明显较低。李莉[7]等也报道了脑血栓患者APCR 发生率为8.3 %。新疆健康人群中APCR发生率和国内(3%～6%)报道相近;脑梗死中APCR发生率在新疆哈萨克族和维吾尔族中较报道高，心肌梗死组APCR发生率与报道相近。说明易栓性疾病患者体内可能存在APCR现象。且各组APCR阳性者均未发现1例 FⅤLeiden突变者。这和欧美国家的APCR阳性患者中有90%系FⅤLeiden所致的报道显然不同，而与国内大多数实验室以及亚洲国家的报道相似，从而也表明APCR 的机制存在着地区、种族差异。在中国人的APCR中，FⅤLeiden 可能不是主要原因。引起APCR的原因有待进一步研究。血浆APCR活性检测对患者的诊断、估计预后和疗效观察有一定的临床参考价值。值得注意的是，调查表明脑梗死组的aPTT 1(加入APC的aPTT)高于正常对照组的，差异有统计学意义(P=0.00)，这和文献报道的不同，其中的原因还需要进一步的研究。

　　3.2 健康人中各少数民族的APCR 均显著高于汉族(P<0.05)，其中哈萨克族组最高，是汉族人群的2.5倍，维吾尔族及回族APCR发生率分别是汉族人群的1.8和1.7倍。 脑梗死组中哈萨克族、维吾尔族人群的APCR发生率分别为30.0%、25.0%，均显著高于汉族人群(P<0.05)， 心肌梗死病例组中维吾尔族人群的APCR发生率(8.33%)和汉族人群的APCR发生率(9.09%)无差别。少数民族正常人和脑梗死组的APCR发生率分别是汉族人群的1.9 倍和2.75倍。国内大多数APCR 的研究都是针对汉族人群的，对少数民族的研究很少。1996年马艳等[8]的研究发现81例新疆维吾尔族的APCR发生率是7.4%。本调查表明在新疆不同民族间APCR的发生率不同，从而也表明APCR 的机制存在着民族差异，今后还需做大规模的多民族的研究。

　　3.3 1994年, Bertina 等[2] 发现大多数APCR发生的分子机制是由于凝血因子Ⅴ( factorⅤ，FⅤ)基因10上的突变为 G1691A 所导致的Arg 506 Gln (FⅤ:R506Q,亦称为 FⅤLeiden)。 FⅤ Leiden突变是导致高加索人静脉血栓栓塞最常见的遗传因素。 我们对APCR阳性的标本，均做了FⅤ Leiden G1691A(Arg 306 The，Arg 306 Gly和 Arg 506 Gln ) 所导致的基因突变检查，未发现1例阳性结果。对易栓患者的APCR和FⅤLeiden的研究，截至目前，在国内(包括台湾地区)进行的包括动脉血栓和静脉血栓患者在内的调查显示，1 683例个体中仅发现3例FⅤLeiden突变杂合子,而219例新疆人(汉族98例，维吾尔族67例，哈萨克族54)中发现2例哈萨克族人FⅤLeiden突变[9] ，说明新疆地区汉族人群APCR 现象并不是由FV Leiden突变而导致的,这与日本、香港和台湾等地区的报道相似。FⅤLeiden突变发生率欧美人达90%，在亚洲人中很少，新疆地区正好位于欧亚大陆交界处，从而验证FⅤLeiden突变在不同种族人群，不同地理位置上的不均匀分布。 因此,研究中国不同民族群体中FV Leiden 的存在情况,对于从分子水平阐明VT发生的致病机理具有一定意义。

　　3.4 王振才等的研究表明： <45岁的缺血性脑血管患者APCR的发生率为46.3% ,明显高于同龄非脑血管病患者的，李小鹰等对心肌梗死患者的研究结论相似[10]。我们的调查显示：<45岁的脑梗死组APCR的发生率为33.3%，与正常人组APCR阳性差异有统计学意义(χ2=7.748，P=0.047)。

　　3.5 凝血酶原20210A突变也可以导致血浆凝血酶原浓度增高，从而造成APCR现象。20210A突变者的APCR阳性率与血浆凝血酶原浓度呈正相关[11]。凝血酶原20210A突变也被认为是静脉血栓形成的重要的遗传危险因素。这一突变是否导致动脉血栓形成尚存在争议[12] 。我们对APCR阳性的标本做凝血酶原G20210A，均未发现基因突变,突变频率为0。进一步说明中国人群中FⅡG20210A的分布频率低， 也不是血栓形成的主要的遗传危险因素。翟振国等[13] 的研究也显示G20210A 变异是欧洲人群重要的致栓因素，但在国内的研究中未发现这种相关性 ,可能有其他的相关基因多态性在起作用。总之，新疆少数民族正常人群中和动脉血栓患者的APCR发生率较高。但未检测出 FV Leiden突变及凝血酶原G20210A突变。

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