ZAP-70在24例B细胞慢性淋巴细胞白血病中的表达研究

　　作者：吴雨洁,李建勇,朱光荣,宋君红,肖冰　　作者单位：南京医科大学第一附属医院血液科，江苏省人民医院，南京 210029;

　　【摘要】为了研究慢性淋巴细胞白血病中zeta链相关蛋白-70(zeta-associated protein-70，ZAP-70)的表达及其与其他预后因素的相关性，应用四色流式细胞术检测24例B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)患者骨髓或外周血白血病细胞ZAP-70和CD38的表达。 结果显示：① 37.5% B-CLL患者表达ZAP-70，其中Binet A期患者有20%(3/15)表达ZAP-70+，Binet B+C期患者有66.7%(6/9)表达 ZAP-70+，ZAP-70+表达在Binet A期和Binet B+C期之间有显著差异(P<0.05);② 29.1% B-CLL患者表达CD38，其中Binet A期患者有3例;在此3例中2例同时伴有ZAP-70+，CD38+在Binet A期和Binet B+C期之间无显著差异(P>0.05);③83.3%(20/24)患者表达ZAP-70+ CD38+ 或ZAP-70-CD38-，ZAP-70和CD38存在相关性(P<0.05)。 结论：在常规实验室可以采用流式细胞术检测ZAP-70，ZAP-70高表达与B-CLL临床分期、染色体及CD38表达等预后相关因素有一定的相关性。

　　【关键词】 慢性淋巴细胞白血病

　　ZAP-70 Expression in 24 Patients with B Cell Chronic Lymphocytic Leukemia　WU Yu-Jie，LI Jian-Yong，ZHU Guang-Rong，SONG Jun-Hong，XIAO Bin　Department of Hematology，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Jiangsu Province People Hospital，Nanjing 210029，China;1Department of Hematology，Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China

　　Abstract To explore the ZAP-70 expression in chronic lymphocytic leukaemia (CLL) and its relationship with other prognostic factors，the expressions of ZAP-70 protein and CD38 in bone marrow or peripheral blood of 24 patients with B-CLL were determined by four-color flow cytometry.The results showed that ZAP-70 was positively expressed in 37.5% of all B-CLL patients，20% (3/15) patients in Binet A stage，and 66.7% in Binet B+C.The expression of ZAP-70 had significant difference between Binet A and Binet B+C (P<0.05).CD38 was expressed in 29.1% of B-CLL patients and 3 out of these cases were in stage A，2 out of 3 cases in stage A co-expressed CD38 and ZAP-70.The expression of CD38 had no significant difference between Binet A and Binet B+C stage (P>0.05).ZAP-70+ and CD38+ were both expressed in 83.3% of B-CLL patients (P<0.05).It is concluded that ZAP-70 protein can be routinely measured by flow cytometry in the laboratory.High expression of ZAP-70 is correlated with other prognostic factors such as clinic stage，chromosome abnormalities and CD38 in B-CLL.

　　Key words chronic lymphocytic leukemia; ZAP-70; CD38

　　Zeta链相关蛋白-70(zeta chain associated protein-70，ZAP-70)是一种与TCRζ相联系的70 kDa蛋白酪氨酸激酶(PTK)，广泛表达在T细胞和NK细胞中，在TCR受刺激后出现可诱导的双磷酸化而激活T细胞信号传导通路。正常B淋巴细胞缺乏ZAP-70，在B细胞的信号传导中，另一种PTK-Syk通过B细胞抗原受体(BCR)复合物起着和ZAP-70相似的作用。部分 B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)的肿瘤细胞处于细胞周期的G0期，BCR水平低于正常B细胞，而ZAP-70在Syk缺陷的B-CLL中，能代替Syk重新构建BCR信号传导通路，从而高表达 ZAP-70[1]。我室采用四色流式细胞术检测CLL的ZAP-70蛋白，结合CD38表达，初步探讨ZAP-70在CLL中的表达特征及其与其他预后指标的相关性。

　　材料和方法

　　病例

　　24例病例均来自2004年8月-2005年3月我院已确诊B-CLL患者，男 15例，女 9例，年龄37-82 岁，其中Binet A 期15例，Binet B+C期9例，后者的6例患者初诊即为Binet B+C期。从诊断到进行此项研究，平均中位时间54个月，其中Binet A期为51个月，Binet B+C期为21个月。所有患者进行外周血常规、外周血涂片和骨髓细胞形态学检查，多参数流式细胞术免疫分型及染色体核型分析。诊断与分期均根据《血液病诊断与疗效标准》[2]确定。实验室检查：外周血WBC>10×109/L，淋巴细胞比例≥50%，绝对值≥5×109/L，骨髓增生活跃或明显活跃，淋巴细胞>40%，以成熟淋巴细胞为主;免疫表型：CD10-，CD19+，CD5+，CD23+，CD20+，FMC7-，并排除其他疾病。

　　试剂和仪器

　　单克隆抗体包括CD5-FITC、ZAP-70-PE、 CD19-ECD、CD38-PC5等及其相应的标记荧光素的同型对照，除ZAP-70及PE标记的同型对照为美国Caltag产品(clone 1E7.2)之外，其余单克隆抗体均为法国Immunotech公司产品。流式细胞仪为Beckman-Coulter公司的Epics XL 型(USA)，采用Expo32-ADC分析软件。

　　流式细胞术检测

　　将新鲜抽取的肝素抗凝的骨髓或外周血(6小时内)调整细胞数至(0.5-1)×106/ml，取100 μl加CD5-FITC/CD19-ECD/CD38-CY5各20 μl，避光15 分钟，加Fix & Perm 试剂盒A固定液100 μl，避光 15分钟加PBS 2 ml，90×g离心5分钟，弃上清轻震细胞后，各管加100 μl B破膜剂5分钟后加ZAP-70 5.5 μl，避光 15分钟，加PBS 2 ml，90×g离心5分钟，弃上清，用1.5 ml PBS重悬，上机检测，至少检测10 000个细胞;同时做同型对照管。

　　ZAP-70蛋白检测

　　ZAP-70检测流程是利用正常T淋巴细胞广泛表达ZAP-70，在CD5和CD19双参数图上将提取CD5单阳细胞置于CD5、ZAP-70双参数图上，作为ZAP-70活性的阳性控制，再提取CD5、CD19双阳性细胞(B-CLL细胞)并分析ZAP-70的表达率，ZAP-70≥20%为阳性[3]。

　　CD38活性分析

　　直接分析CD5、CD19双阳性细胞CD38的表达率。CD38≥20%为阳性。

　　统计学处理采用χ2检验。

　　结 果

　　24例B-CLL诊断结果

　　所有患者均排除其他疾病，细胞形态学及免疫分型均诊断为B-CLL;染色体异常核型检出率为20.8%(5例)，其中1例11q-，1例13q-，1例+12，2例核型复杂异常。

　　ZAP-70蛋白表达与临床分期的相关性

　　24例B-CLL中 ZAP-70+ 9例(37.5%)，ZAP-70-15例(62.5%)(图1)。根据Binet分期，9例ZAP-70+患者中A期3例(33.3%)，B+C期6例(66.7%);15例ZAP-70-患者中，A期12例(80.0%)，

　　B+C期3例(20.0%)。15例A期患者20% ZAP-70+(3/15)，80.0% ZAP-70-(12/15)，9例B+C期患者66.7% ZAP-70+(6/9)，33.3% ZAP-70-(3/9)，ZAP-70+在Binet A期和Binet B+C期间有显著差异(P<0.05)(表1)。Table 1. ZAP-70 expression and Binet stage in 24 patients with B-CLL(略)

　　CD38表达与临床分期的相关性

　　24例B-CLL中 CD38+ 7例(29.1%)，CD38-17例(71.9%)(图1)。根据Binet分期，7例CD38+中，A期3例(42.9%)，B+C期4例(57.1%);17例CD38-中，A期12例(70.6%)，B+C期5例(29.4%)。15例A期患者20%CD38+(3/15)，80%CD38-(12/15);9例B+C期患者44.4%CD38+(4/9)，55.6% CD38-(5/9)，CD38+在Binet A期和Binet B+C期间无显著差异(P>0.05)(表2)。Table 2. CD38 expression and Binet stage in 24 patients with B-CLL(略)

　　ZAP-70与CD38表达的相关性

　　将所有病例分为2组，ZAP-70+ CD38+ /ZAP-70-CD38-组占83.3%(20/24)，ZAP-70+CD38-/ZAP-70-CD38+占16.7%(4/24)，两组间有显著差异(P<0.05)(图2)。

　　讨 论

　　B-CLL是一种低度恶性的小淋巴细胞异质性疾病，临床上预后差异大，预后相关因素多[4，5]，在多种预后参数中，IgVH基因有无突变是CLL最好的预后指标[6，7]，但基因测序价格昂贵，步骤繁琐，一般诊断实验室难以开展，最近发现ZAP-70的表达与IgVH是否发生突变极具相关性，与IgVH突变的CLL相比IgVH未突变CLL信号传导显示了更高程度的酪氨酸磷酸化水平，且在整个病程中始终不变，因而认为ZAP-70高度的敏感性和特异性可完全替代IgVH基因突变作为CLL最有效的预后指标[1，8]。

　　Durig等[3]将77例CLL分为ZAP-70+、ZAP-70-两组;ZAP-70+占47.9%，ZAP-70-占52.1%，ZAP-70+在Binet A期占29%，明显低于Binet B+C期的71%，比较各自的中位生存期(median survival，MS)，ZAP-70+组为139个月，ZAP-70-组>300个月(P=0.013)，临床上ZAP-70+组多呈进展性表现，需要更长的治疗时间和更强烈的化疗(P=0.0001)。我们在国内首次采用四色流式细胞术检测B-CLL中ZAP-70蛋白表达，已确诊的B-CLL按Binet 分期，Binet A期占58.3%，Binet B+C期占41.7%，各期比例与文献报道大致相等[9]。A期患者20% ZAP-70+(3/15)，3例ZAP-70+患者中1例女性患者，发病年龄为37岁，染色体核型复杂异常，初诊时淋巴细胞18×109，8个月后淋巴细胞增高至44×109，趋向于急进性临床过程，考虑为高危患者，给予福达华为主的治疗;1例检测到异常染色体核型：11q-，β2-MG>10 000 μg/L，给予COP为主的治疗，提示ZAP-70高表达与其他不良预后特征相关。Binet B+C期患者中66.7%(6/9)初诊即为此期，ZAP-70表达增高，ZAP-70+Binet A与Binet B+C期之间有显著性差异(P< 0.05)。

　　CD38是一种能够促使B细胞活化和增殖的Ⅱ类跨膜糖蛋白，与CLL预后的相关性争论颇多[8，10，11]。Mainou-Fowler等[11]认为，其平均荧光强度可作为CLL独立的预后指标;Wiestner等[12]认为CD38随着病程的进展会发生相应变化，其中包括一些刺激(如佛波酯、干扰素等)的诱导作用，CD38的这种改变在临床上使其可作为CLL的一种病情进展的指标。由于CD38的表达在免疫分型中尚无统一的阳性标准，我们按最新文献[8]将表达率≥20%定为阳性标准，检测了CD38的表达与Binet分期的相关性，结果显示Binet A期患者CD38表达减低，2例CD38+Binet A患者同时伴有ZAP-70+，CD38+在Binet A期和Binet B+C期间无显著差异(P>0.05)。同时分析有83.3%(20/24)患者表达ZAP-70+CD38+ 或ZAP-70-CD38-，说明ZAP-70和CD38存在相关性(P< 0.05)，CD38和预后的关系将有待大样本研究及阳性标准的统一以明确结论。

　　本研究表明，ZAP-70高表达与B-CLL临床分期、染色体及CD38表达等预后相关因素有一定的相关性，但由于病例数较少、患者的异质性较大(如病期、病程等)、随访时间短等原因，关于ZAP-70在我国B-CLL的表达特征及其预后意义有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Chen L，Widhopf G，Huynh　L，et al.Expression of ZAP-70 is associated with increased B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia.Blood，2002;100: 4609-4914

　　2 张之南等.血液病诊断及疗效标准.第二版，科学出版社.北京:1998: 228-236

　　3 Durig J，Nuckl H，Cremer M，et al.ZAP-70 expression is a prognostic factor in chronic lymphocytic leukaemia.Leukemia，2003;17: 2426-2434

　　4 Dighiero G，Binet JL.When and how to treat chronic lymphocytic leukemia.N Engl J Med，2000; 343: 1799-1801

　　5 Montserrat E.Treatment options in chronic lymphocytic leukemia.Hematol J，2004; 5(Suppl): S2-9

　　6 Hamblin TJ，Davis Z，Gardiner A，et al.Unmutated IgV(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia.Blood，1999; 94: 1848-1854

　　7 Stilgenbauer S，Bullinger L，Lichter P，et al.Genetics of chronic lymphocytic leukemia: genomic aberrations and IgV(H) gene mutation status in pathogenesis and clinical course.Leukemia，2002; 16: 993-1007

　　8 Crespo M，Bosch F，Villamor N，et al.ZAP-70 expression as surrogate for immunoglobulin-variable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia.N Engl J Med，2003; 348: 1764-1775

　　9 Vasconcelos，Davi F，Levy V，et al.Binet′ s staging system and VH genes are independent but complemntary prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.J Clin Oncol，2003; 21: 3928-3932

　　10 Damle RN，Wasil T，Fais F，et al.Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.Blood，1999; 94: 1840-1847

　　11 Mainou-Fowler T，Dignum HM，Proctor SJ，et al.The prognostic value of CD38 expression and its quantification in B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL).Leuk Lymphoma，2004; 45: 455-462

　　12 Wiestner A，Rosenwarld A，Barry TS，et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes，inferior clinical outcome，and distinct gene expression profile.Blood，2003; 101: 4944-4951