正常人骨髓不同细胞群中WT1基因表达及其异构体比例研究

　　作者：徐菁,王宏伟,李晓红,朱镭,张丽　　作者单位：山西医科大学第二医院血液病研究所， 太原 030001

　　【摘要】本研究探讨WT1基因在正常人骨髓不同分化阶段造血细胞中的表达程度及异构体间比例关系。 采用实时荧光定量RTPCR方法检测18例正常人骨髓标本中CD34+CD38-、CD34+CD38+、CD15+CD11b+、CD33+CD14+、CD20+CD5-和CD20-CD5+细胞群中总WT1、WT1(+17AA)及WT1(+KTS)的表达。结果表明： 与K562细胞相比，CD34+CD38-、CD34+CD38+、CD15+CD11b+和CD33+CD14+ 细胞群中均存在WT1基因的低表达，且依次逐渐降低;在 CD20+CD5-和CD20-CD5+ 细胞群中未检测到WT1基因表达。在分化程度较低的CD34+CD38-和CD34+CD38+细胞群中以+17AA，+KTS及WT1(+/+)异构体为主，而较成熟的CD15+CD11b+和CD33+CD14+细胞群中以17AA、KTS及WT1(/)异构体为主。结论： 在正常人骨髓细胞中WT1基因的表达随着细胞分化程度提高而降低，造血细胞可能通过其4种异构体比例的调整而发挥抑制或促进分化的作用。

　　【关键词】 骨髓　WT1基因　 WT1基因异构体　 基因表达

　　WT1 Gene Expression and Its Isoform Ratio in Different Cell Subsets of Normal Human Bone Marrow XU Jing, WANG HongWei, LI XiaoHong， ZHU Lei， ZHANG Li， ZHANG Fan, TAN YanHong， YANG Tao Institute of Hematology, The Second Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

　　Abstract The Wilms' tumor gene (WT1) is a transcription factor involved in tumorigenesis, especially in leukemogenesis. However, the role of WT1 expression in nonmalignant hematopoietic cells remains unclear. Furthermore, due to alternative splicing at two sites: 17 amino acid residues of exon 5 (+17AA) and 3 amino acid residues (+KTS) between exons 9 and 10, WT1 gene has four main isoforms (17AA+/KTS+, 17AA+/KTS, 17AA/KTS+, 17AA/KTS , abbreviation: +/+，+/，/+，/) . The isoforms probably existed in hematopoietic cells, which make the research more complex. The aim of study was to elucidate the expression and its isoforms of WT1 gene in different cell subsets of healthy bone marrow donors. The fluorescence RTPCR detection system was established to measure the expressions of fulllength WT1, WT1(+17AA) and WT1(+KTS) in CD34+CD38(stem cell) , CD34+CD38+(progenitor cell), CD15+CD11b+ (granulocyte), CD33+CD14+(monocyte), CD20+CD5- (Blymphocyte) and CD20-CD5+ (T lymphocyte ) subsets from 18 normal human bone marrow samples. The results showed that WT1 expressed in CD34+CD38-, CD34+CD38+, CD15+CD11b+ and CD33+CD14+, but not in CD20+CD5- and CD20-CD5+ subsets. The highest expression was in CD34+CD38-, but decreased gradually in CD15+CD11b+ and CD33+CD14+ subsets. WT1(+17AA), WT1(+KTS) and WT1(+/+)isoforms were predominant in CD34+CD38- and CD34+CD38+ primitive subsets, while in CD15+CD11b+ and CD33+CD14+ the dominant isoforms were WT1(17AA), WT1(KTS) and WT1(/). It is concluded that the expression of WT1 in normal bone marrow decreases gradually with cell differentiation. Hematopoietic cells may adjust the ratios of WT1 isoforms to inhibit or promote cell differentiation.

　　Key words bone marrow; WT1 gene; WT1 gene isoform; gene expression

　　J Exp Hematol 2007; 15(3):603-606

　　WT1基因(Wilms瘤基因)作为一种重要的转录调控因子参与许多肿瘤特别是白血病的发生。WT1 mRNA经过选择性剪接可以编码4种同源异构体[1]。在第5外显子处，编码17个氨基酸插入调控区与锌指区之间，可把WT1表达蛋白分为+17AA及17AA两种异构体。在第9外显子末端即第3和第4锌指结构之间插入KTS(LysThrSer) 3个氨基酸，从而又可将WT1表达蛋白分为+KTS和KTS两种异构体。通过不同的组合，可细分为4种主要的剪接体。这4种不同的含锌指结构的DNA结合蛋白分别为 +17AA/+KTS 、 +17AA/KTS、 17AA/+KTS和 17AA/KTS， 以下分别简称为(+/+、+/、/+和/)。许多研究表明，4种异构体在转录、剪接和调控细胞基本功能如增殖，分化及凋亡方面各不相同[2]。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)正常人骨髓不同细胞群中WT1基因表达及其异构体比例研究早期研究表明，WT1只在正常骨髓CD34+细胞中表达，而在分化成熟细胞中不表达。 Ellisen等[3]证实，正常造血细胞分化成熟过程中WT1会出现第2次高表达,那么真实情况如何，特别是细胞分化成熟的不同阶段4种异构体的表达比例如何，目前尚不清楚。本研究采用特异性好、灵敏度高的实时荧光定量RTPCR技术，同时借助流式细胞分选手段对正常造血过程中WT1基因的表达程度及其不同异构体构成比例进行系统地研究，旨在为进一步探讨WT1在白血病发生机制中的作用奠定基础。

　　材料和方法

　　研究对象

　　18份健康供者骨髓标本，以WT1表达的白血病细胞系K562作为阳性对照。

　　主要试剂

　　荧光抗体FITCCD34、CD15、CD33、CD20、IgG, PECD38、CD11b、CD14、CD5、IgG，Pc5CD45均购自PharMingen公司。 CellstocDNATMII购自美国Ambion公司，引物及探针由上海基康公司合成，荧光定量试剂盒购自TaKaRa公司。

　　抗体标记方法

　　取抗凝骨髓2-5 ml,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，计数(5-10)×106细胞，分别标记CD34/CD38/CD45、CD15/CD11b/CD45、CD33/CD14/CD45、CD20/CD5/CD45，每种抗体各20 μl，暗室孵育30分钟;另外,CD15/CD11b/CD45抗体标记采用新鲜抗凝骨髓30 μl，每种抗体分别加5 μl，加1×PBS 30 μl，暗室孵育30分钟后裂解红细胞。所有标记细胞置于冰上直至分选。

　　细胞的流式细胞仪分选

　　用Beckman Coulter EPICS Elite分选型流式细胞仪,根据仪器手册设置好各项参数,安装分选器,使用标准荧光微球(CoulterImmunotech公司产品)调试最佳Delaytime和Drive值。初始设门采用侧向角(side scatter, SSC)散射和CD45设门，进行细胞分群。 选定原始细胞群，第2设门将初始设门中的原始细胞引入CD34/CD38门，分选CD34+CD38+(干细胞)/ CD34+CD38-(祖细胞);同理，选定单核细胞群，分选CD33+CD14+(单核细胞);选定淋巴细胞群，分选CD20+CD5-(B淋巴细胞)，CD20-CD5+(T淋巴细胞);选定粒细胞群，分选CD15+CD11b+(粒细胞)，分别分选1 000个细胞进行检测。

　　RNA的提取和cDNA的合成

　　依据CellstocDNATMII试剂说明书进行。

　　荧光定量RTPCR检测

　　引物及探针自行设计，由上海基康公司进行合成，序列如下:

　　总WT1探针：5'FAMCGGAGCCCAATACAMGB3'， 正向引物：5'GATAACCACACAACGCCCATC 3'， 反向引物：5'CACGTCGCACATCCTGAATG3' ;

　　+17AA探针：5'FAMCAGCACAGGGATCGAGAMGB3'; 正向引物：5'TGGACAGAAGGGCAGAGCA3'， 反向引物：5'GGATGGGCGTTGTGTGGT3';

　　+KTS探针：5'FAMTTCCGGTCCGACCAMGB3'， 正向引物：5'CAAAAGACACCAAAGGAGACATACA3'， 反向引物：5'CTGAAGGGCTTTTCACTTGTTTTAC3';

　　βactin探针：5'FAMATCATTGCTCCTCCTGAGMGB3'， 正向引物：5'GCTCAAAAGACACCAAAGGAGAC3'， 反向引物：5'AGCTGAAGGGCTTTTCACTTGTTT 3'。

　　反应体系25 μl： 包括TaqMan Core Regeants 12.5 μl,10 μmol/L引物各2.25 μl,10 μmol/L探针0.625 μl，cDNA 2 μl，补水至25 μl。反应条件：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟;95℃ 30秒，60 ℃ 30秒，45个循环。反应设立内对照βactin。将WT1/βactin、+17AA/βactin、 +KTS/βactin分别作为WT1基因及+17AA、+KTS异构体的相对表达量 [4]。

　　不同异构体表达比例计算方法如下：

　　+17AA表达比例= +17AA/ 总WT1; +KTS 表达比例= +KTS/总WT1; WT1(+/+)表达比例=(+17AA/总WT1) × (+KTS/总WT1); WT1(+/)表达比例= (+17AA/ 总WT1) ×(1 KTS+/总WT1); WT1(-/+)表达比例=(1 17AA+/ 总WT1) × (+KTS/总WT1); WT1(/)表达比例= (1 17AA+/ 总WT1) ×(1 KTS+/总WT1)。

　　统计学分析

　　应用SPSS 11.5统计学软件处理数据。原始数据符合正态分布的采用±SD表示;不服从正态分布的经对数转化后服从正态分布。应用单因素方差分析各组间数据的差异，均数两两比较采用SNKq检验。

　　结 果

　　正常骨髓不同细胞亚群WT1表达水平

　　除CD5+CD20-和CD5-CD20+细胞群未检出表达外，其余各群细胞总WT1的表达水平详见表1。与阳性对照K652细胞系的(4.67±2.95)×10-3表达相比，正常人骨髓中各细胞群表达明显降低，其中CD34+CD38- 细胞群的表达水平约为K652细胞系的1/10。

　　正常骨髓不同细胞亚群+17AA、+KTS异构体比例

　　正常人骨髓中CD34+CD38-和CD34+CD38+细胞群以+17AA、+KTS为主;而在 CD33+CD14+和CD15+CD11b+细胞群中+17AA、+KTS两类异构体的比例明显下降，其中以+17AA比例下降更为显著 (表2)。

　　正常骨髓不同细胞亚群WT1 4种异构体表达比例

　　K562细胞株、CD34+CD38-及CD34+CD38+细胞群均以WT1(+/+)异构体为主，分别为0.40±0.09、0.37±0.03、 0.32±0.05 ，组间比较有显著性差异(P<0.05);CD15+CD11b+和CD33+CD14+细胞群中则以WT1(/)异构体为主 (表2及附图)。

　　讨 论

　　早期研究认为WT1仅在CD34+的干/祖细胞表达，而在CD34-细胞及外周血分化成熟细胞中不表达。Inoue 等[5]曾采用流式细胞仪分选及定量RTPCR技术证实，骨髓中CD34+不同细胞亚群(根据CD33，CD38,HLADR和ckit表达与否)中存在WT1基因的低表达，且各亚群之间表达无差异。 Ellisen等[3]则证实，正常造血细胞分化成熟过程中WT1出现两次阶段性表达：首先在处于G0期的未定向分化的干细胞中表达，在定向分化祖细胞中表达下降，但在较成熟的B细胞(CD19+CD3-)、粒细胞(CD11b+CD14-)、单核细胞(CD11b+CD14+)中又出现高表达。我们的实验通过荧光定量RTPCR也发现，CD34+CD38-(干细胞)、CD34+CD38+(祖细胞)、CD15+CD11b+(粒细胞)、CD33+CD14+(单核细胞)中均存在WT1的表达，但未出现阶段性高表达。Maurer等[6]使用粒细胞刺激因子(GCSF)诱导体外培养的骨髓CD34+前体细胞向粒细胞分化时，发现随着粒细胞抗原标记CD33、CD15、CD11b表达的逐渐增高，WT1逐渐降低，我们结果与其一致。

　　Renshaw等[7]研究发现，17AA的表达比例与细胞发育阶段、组织特异性、种属特异性有关。本实验的结果提示，CD34+的原始干/祖细胞中以+17AA为主，在早期开始分化的祖细胞中表达稍有下降，而成熟单核/粒细胞中+17AA异构体比例明显减低，17AA异构体比例增加.这提示+17AA异构体在细胞分化阻滞中起主要作用。研究表明，+KTS与KTS两类异构体在基因的转录和剪接方面具有不同作用。Ellisen等[3]将+KTS与KTS共转染入U937细胞,提示单独+KTS不能发挥促进细胞分化的作用，而WT1KTS可通过p21CIP1使细胞停滞在G1期，抑制增殖从而促进细胞的分化。本研究结果显示：在CD34+的原始干/祖细胞中+KTS比例要高于KTS,而成熟的单核/粒细胞中KTS异构体比例明显增加。

　　在同样以正常的原始造血祖细胞32DCL3为靶细胞的研究中， lnone等[8]报道WT1(+/+)异构体可抑制细胞的分化,促进细胞的增殖。而Loeb等[9]则报道WT1(/)异构体可抑制G1/S期过程，增强GCSF介导的粒细胞的成熟分化。本实验分析了正常骨髓细胞中WT1的4种异构体表达水平及比例的变化，结果表明随着细胞逐渐趋于成熟，WT1(+/+)的表达水平迅速降低，而WT1(/)的表达水平有逐渐增高的趋势，我们的结论与上述通过体外转染进行功能研究的结论是相互支持的。

　　以上结果表明，WT1基因在正常造血过程中可能通过调整4种异构体之间比例的改变而发挥抑制或促进分化的作用。

　　【参考文献】

　　1Scharnhorst V, vanderEb AJ, Jochemsen AG. WT1 proteins: functions in growth and differentiation. Gene, 2001; 273:141-161

　　2段卫明，陈子兴. WT1介导的转录调控通路与白血病. 中国实验血液学杂志，2002; 10：366-370

　　3Ellisen LW, Carlesso N, Cheng T,et al. The Wilms tumor suppressor WT1 directs stagespecific quiescence and differentiation of human hematopoietic progenitor cells. EMBO J, 2001;20:1897-1909

　　4白波，王宏伟，徐永群等. 荧光定量PCR检测急性白血病患者外周血WT1基因表达及其临床意义. 中国实验血液学杂志，2005;13：610-614

　　5Inoue K, Ogawa H, Sonoda Y, et al. Aberrant overexpression of the Wilms tumor gene in human leukemia. Blood, 1997, 89: 1405-1412

　　6Maurer U, Brieger J, Weidmann E, et al. The Wilms' tumor gene is expressed in a subset of CD34+ progenitors and downregulated early in the course of differentiation in vitro. Exp Hematol, 1997; 25:945-950

　　7Renshaw J, KingUnderwood L, PritchardJones K. Differential splicing of exon 5 of the Wilms' tumour (WT1) gene. Genes Chromosomes Cancer, 1997; 19: 256-266

　　8Inoue K, Tamaki H, Ogawa H, et al. Wilms' tumor gene (WT1) competes with differentiationinducing signal in haematopoietic progenitor cells. Blood, 1998; 91: 2969-2976

　　9Loeb DM, Summers JL, Burwell EA, et al. An isoform of the Wilms' tumor suppressor gene potentiates granulocytic differentiation. Leukemia, 2003; 17: 965-971