RTPCR法检测白血病干细胞Flt3和Nras基因的表达

　　作者：徐瑞荣,王晓玲,王敬毅,崔兴,王琰　　作者单位：山东中医药大学附属医院血液科 济南 250011

　　【摘要】目的：采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测益气养阴方及其拆方后的扶正方组、祛邪方组急性白血病干细胞Flt3和Nras基因的表达，以期阐明Flt3和Nras基因表达与疾病发生、发展的关系。方法：RTPCR法检测中药益气养阴方组、扶正方组、祛邪方组及对照组AML患者骨髓单个核细胞Flt3和Nras基因表达的情况。结果：Flt3和Nras基因表达阳性率益气养阴组、扶正组、祛邪组与对照组比较，差异有显著性意义(P均<0.01);益气养阴组与扶正组和祛邪组比较，差异有显著性意义(P均<0.01);扶正组与祛邪组比较，差异无显著性意义(P>0.05);各FAB亚型AML间Flt3与Nras表达阳性率比较，差异无显著性意义(P>0.05)。结论：中药益气养阴方可降低Flt3和Nras基因在AML细胞的表达水平，抑制AML细胞的克隆性增殖，对AML具有治疗作用。

　　【关键词】 白血病干细胞 RTPCR Flt3 Nras

　　机体的造血过程复杂，受多种正负调控因子的调控。这些造血生长因子或细胞因子的调控失衡，可导致某一细胞系的过度增殖，甚至出现白血病改变。Flt3受体(fmslike tyrosine kinase receptor III,FR)是Lyman等于1993年发现的一种细胞表面酪氨酸激酶受体III( class IIIreceptortype tyrosine kinases,RTK III) [1]。Flt3基因是近年发现的早期造血生长因子受体基因，它与ckit、cfms同属于III型酪氨酸激酶家族。在70%～90%患者的白血病细胞上有Flt3过表达，而在白血病以外的肿瘤细胞中至今未有Flt3表达的报道。Flt3被认为是白血病特异性的靶分子[2～4]。Ras癌基因是一个普遍存在的真核基因家族，其命名来自大鼠肉瘤( rat sarcoma)的字首，1964年首次从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒(Harvey rat sarcoma virus和Kister rat sarcoma virus)中分离出来。ras癌基因可分为Nras、Kras和Hras三类，在造血系统恶性疾病中Nras癌基因是ras癌基因突变体最高的一种，在急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia AML)中有20%～30%可出现Nras癌基因点突变[5] 。国内外研究尚未见有关中药复方对Flt3和Nras基因在急性白血病细胞中表达影响的研究报道。本文通过运用RTPCR方法，检测了60例急性髓细胞性白血病病人的骨髓单个核细胞中Flt3和Nras基因mRNA的表达，旨在阐明Flt3和Nras基因表达与疾病发生、发展的关系，探讨中药益气养阴方治疗急性髓细胞白血病的作用机制。

　　1 实验材料

　　1.1 实验对象 2006～2007年山东中医药大学附属医院、山东大学齐鲁医院血液科就诊的AML初治患者60例，男35例，女25例，年龄6～56岁，中位年龄31岁。均经骨髓细胞形态学、组织化学和流式细胞术免疫分型确诊为AML。FAB分型M1型5例，M2型15例，M4型9例，M5型20例，M6型8例，M7型3例。

　　1.2 仪器与试剂 PCR扩增仪(HYBAID，UK);电泳仪(DYYⅢ2,北京六一仪器厂)，水平电泳槽(DYY—Ⅲ32,北京六一仪器厂);高速离心机(ALLEGRA64R,美国BECKMAN公司);BB16气体培养箱、HFsafe1200型生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司);252型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂);凝胶成像仪(天能科技上海有限公司)。

　　Trizol( 美国Invitrogen);氯仿;异丙醇;乙醇;DEPC(美国SIGMA公司);引物合成(上海生工生物工程技术有限公司);PrimeScriptTM RTPCR Kit试剂盒(DRR014A TaKaRa);DNAMarker(北京全式金生物技术有限公司);Flt3、Nras、βactin基因引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。Flt3：L：5′TCAAGTGCTGTGCATACAATTCCC3′，R：5′CACCTGTACCATCTGTAGCTGGCT3′，186bp;Nras：L：5′AATCCAGCTAATCCAGAACC3′，R：5′TGGTCTCTCATGGCACTGTA3′，131bp;βactin：L：5′AGCGAGCATCCCCCAAAGTT3′，R：5′GGGCACGAAGGCTCATCATT3′，285bp。无酚红RPMI1640培养液(美国GBICO公司);胎牛血清(杭州四季青);淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液病研究所产品)。

　　1.3 中药组成及制备 益气养阴方：黄芪、白花蛇舌草、小蓟、太子参、半枝莲、蒲公英、生地、黄精、女贞子、旱莲草、天冬、白术、茯苓、甘草。扶正方：黄芪、太子参、生地、黄精、女贞子、天冬、麦冬、白术、茯苓、甘草。祛邪方：白花蛇舌草、小蓟、半枝莲、蒲公英、旱莲草。

　　药物制备：上述三组药物由我院中药制剂实验室(国家三级重要制剂实验室)配制成1g/ml的药液，罐装于250ml输液瓶中，流通蒸汽于105℃灭菌，无菌试验阴性后用RPMI1640液(含青、链霉素各100u/ml),正压过滤除菌，备用。

　　2 实验方法

　　2.1 骨髓单个核细胞的提取 常规无菌采集骨髓5ml，肝素抗凝;用10ml离心管，先注入5ml淋巴细胞分离液，再将骨髓液缓缓注入，使其浮于分离液上层;水平离心1800r/min，20min;将离心管垂直缓慢移入超净工作台，用毛细吸管仔细吸取中间白色悬浮层，PBS液洗2次，细胞计数。

　　2.2 细胞培养 骨髓单个核细胞提取后，置37℃、5%CO2 及饱和湿度的细胞培养箱中培养到对数生长期，将细胞换液。细胞混悬液分成四组：对照组加入生理盐水，实验组分别加入益气养阴方、扶正方、祛邪方中药制剂，终浓度为100μg/ml。震荡均匀，置37℃、5%CO2 及饱和湿度的细胞培养箱中继续培养48小时后冻存。

　　2.3 BMMNC总RNA提取 将冻存管的细胞复苏，用Trizol试剂盒按其说明书提取总RNA。抽提的RNA用DEPCH2O溶解，测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量，按1OD 260=40μg RNA计算RNA的浓度，OD260/280在1.8～2.0视为抽提RNA纯度很高;用2%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳后若能看到分子量从大至小三条带：28s、18s及5s条带(但5s带一般模糊，有时消失;28s、18s带应清晰明亮，大致呈2∶1关系)，视为提取出的总RNA完整性好，无降解。

　　2.4 RT反应 标本总RNA 2μg， Oligo DT Primer 1μl,dNTP Mixture(各10mM) 1μl,加RNase Free dH2O至10μl,在PCR仪上65℃ 反应5 min。在上述PCR管中配制反转录反应液：5×PrimerScript Buffer 4μl,Rnase Inhibitor(40U/μl) 0.5μl,PrimerScript RTase 0.5μl,RNase Free dH2O 5μl。总逆转录体系 20μl,42℃反应30min,95℃反应5min，置4℃保存。

　　2.5 PCR反应 反应体系为50μl,包括cDNA 3μl、10×PCR Buffer 5μl、dNTP Mixture 2μl、特异性上游引物0.5μl,特异性下游引物0.5μl、TaKaRa ExTaqHS 0.5μl,加RNase Free dH2O至50μl。将PCR小管放入PCR仪中，调整PCR仪的参数如下。Flt3:预变性94℃ 5min,变性94℃30s,退火60℃30s,延伸72℃ 45s(35Cycles)72℃ 10min;Nras:预变性94℃ 5min，变性94℃30s，退火55℃ 45s，延伸72℃45s(40 Cycles)72℃10 min;βactin：预变性94℃5 min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃45s(35Cycles)72℃5min。

　　2.6 琼脂糖凝胶电泳 反应结束后，取15μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，120V 80mA电泳35min。电泳后，在凝胶成像系统分析仪下摄片、分析。

　　2.7 统计学处理 结果以(±s)表示,使用SPSS13.0 统计软件包进行单因素方差分析。

　　3 实验结果

　　3.1 Flt3表达情况 Flt3基因检测阳性患者经PCR扩增后在186bp位置可发现特异性条带。60例AML患者Flt3基因表达阳性率见表1。10名正常骨髓Flt3基因检测均为阴性。表1 AML患者Flt3表达阳性率例/

　　3.2 Nras基因表达情况 Nras基因检测阳性患者，经PCR扩增后在131bp位置可发现特异性条带。60例AML患者Nras基因表达的检测结果见表2。10名正常骨髓Nras基因检测均为阴性。表2 AML患者Nras表达阳性率例

　　3.3 各组Flt3和Nras基因表达阳性率 益气养阴组、扶正组、祛邪组Flt3、Nras表达阳性率与对照组比较，差异有显著性意义(P均<0.01);益气养阴组与扶正组和祛邪组比较，差异有显著性意义(P均<0.01);扶正组与祛邪组比较，差异无显著性意义(P>0.05);各FAB分型AML间Flt3、Nras基因表达阳性率差异无显著意义(P>0.05)，见表3、4,图1～3。 表3 各组Flt3基因表达阳性率比较(

　　4 讨 论

　　急性白血病的主要致病因素是造血细胞的克隆扩增、分化障碍，这种分化和死亡程序及对信号分子反应的变化是基因改变的结果，其基因的产物就是一些造血生长因子受体，并在造血细胞上表达。

　　Flt3广泛分布表达在多种组织，如脑、胸腺、胎盘、淋巴结、脾、肝等组织。研究表明，Flt3受体以髓细胞系和单核细胞系表达率高，巨核细胞系只有少量表达，淋巴细胞只有ProB及PreB细胞表达Flt3受体，而成熟的T、B细胞不表达。Flt3基因在白血病中广泛高表达,并与疾病转归相关,有望成为白血病的泛基因。近年的研究发现，70%～100%的AML,50%以上的ALL及CML(慢性髓性白血病)加速期、急变期有Flt3高表达[6]。

　　Nras癌基因是急性髓细胞性白细胞(AML)最常被检测到的基因异常，Nras癌基因在ras基因突变中所占比例最高,白血病又以AML最常被检测到Nras,其主要是Nras癌基因突变,少有Kras及 Hras突变[7]。采用PCR技术,Nras突变在AML中的检出率约24%[7,8]。有学者[8]认为，ras基因点突变可作为白血病细胞分子标志用于检测微量残留白血病(MRLC)。Nras癌基因可作为AML基因突变的一个指标应用于诊断和预后判断。

　　本研究结果显示，Flt3和Nras基因在AML患者表达阳性率很高。正常骨髓Flt3和Nras表达为阴性。中药益气养阴方可降低白血病细胞Flt3和Nras基因的表达，与扶正组、祛邪组比较，差异有显著意义(P均<0.01);中药益气养阴方能够降低Flt3和Nras基因表达水平，抑制AML细胞的克隆性增殖，对AML具有治疗作用。

　　【参考文献】

　　1 Rosnet O,Schiff C,Pebusque MJ,et al.Human Flt3/ FLK2 gene:cDNA cloning and expressin in hematopoietic cells.Blood,1993,82(4):11101119

　　2 Ozeki K,Kiyoi H,Hirose Y,et al,Biologic and clinical significance of the Flt3 transcript level in acute myeloid leukemia.Blood,2004,103(5):19011908

　　3 Meshinchi S,Woods WG,Stirewalt DI,et al,Prevalence and prognostic significance of Flt3 internal tandem duplication in pediatric acute myeloid leukemia.Blood,2001,97(1): 8994

　　4 Gilliland DG,Griffin JD.The roles of FLT3 in hematopoiesis and leukemia.Blood,2002,100(5):15321542

　　5 Farr CJ,Saiki RK,Erlich HA,et al.Analysis of ras gene mutations in acute myeloid leukemia by polymeras chain reaction and oligonucleotide probes.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85(5):16291633

　　6 Auewarakul CU,Sritana N,Limwongse C,et al.Mutations of the Flt3 gene in adult acute myeloid leukemia:determination of incidence and identification of a novel mutation in a Thai population.Cancer Genet Cytogenet,2005,162(2):127134

　　7 Browett PJ,Norton JD.Analysis of ras gene mutations and methlation state in huam leukemia.Oncogene,1989,4(8):10291036

　　8 Daniel R,Jacobson,Nancy E.A highly sensitive assay for mutation ras genes and its application to the study of presentation and relapse genotypes in Acute leukemia.Oncogene,1994,9:553563