人参二醇促骨髓CD34+细胞增殖和分化的研究

　　作者：方桂伦*,高瑞兰,林筱洁,金锦梅　　作者单位：浙江中医药大学附属第一医院，血液病研究所，杭州 310006

　　【摘要】本研究探讨人参二醇 (PDS) 对正常人骨髓CD34+细胞的促进增殖和诱导分化作用。用吸附单克隆抗体的免疫磁珠技术从正常人骨髓分离出CD34+ 细胞，采用琼脂半固体多向祖细胞集落(CFUMix)培养方法观察PDS对CD34+ 细胞的增殖作用;用液体培养使CD34+细胞增殖，并向红系、粒系定向生长，用流式细胞仪分析PDS诱导后细胞表面标记变化。结果显示：免疫磁珠分离CD34+ 细胞的获得率占骨髓有核细胞(MNC)的(1.0±0.15)%;活细胞比例占(95.6±1.2)%，CD34+ 细胞富集度达(86.8±2.8)%。 中浓度PDS (25 mg/L)能够有效地促进CD34+ 细胞增殖，生成CFUMix集落，提高率为(56.3±3.5)%，与对照相比较有显著差异(p<0.01)。液体培养生成粒系、红系细胞的数量明显增高，与对照相比差异有显著性，提高率分别为(35.6±3.2)%和(22.3±2.1)%，与对照相比差异有显著性(p<0.01)，且呈剂量依赖性。经PDS诱导14天后,细胞表面分化标记明显增高，CD33+ 细胞在PDS 50 mg/L时最高，CD71+ 细胞在25 mg/L时最高，GA+ 细胞在10 mg/L时最高，而CD15+ 细胞数量无明显变化。结论：PDS不但促进CD34+细胞增殖，且能诱导其定向分化，提示PDS具有类似造血生长因子和协同生长因子的效应。

　　【关键词】 人参二醇

　　Effects of Ginseng Panaxadiol Saponin on Proliferation and Differentiation of Human Bone Marrow CD34+ Cells FANG GuiLun*，GAO RuiLan，LIN XiaoJie, JIN JinMei Institite of Hematology, Affiliated Hospital, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310006, China

　　Abstract The study was purposed to investigate the effects of the panaxadiol saponin (PDS) from Ginseng on proliferation and differentiation of human CD34+ cells from human bone marrow. Highly purified CD34+ cells were isolated from human bone marrow by using the Dynal CD34 Cell Selection System (Dynal, Norway). The cells were exposed to PDS at various concentrations in both agar semisolid culture of CFUMix and suspension culture of myeloid and erythroid cells in order to observe the effects of PDS on proliferation of CD34+ cells. The cells were marked with 4 kinds of monoclonal antibody in related with their differentiation toward to myeloid and erythroid lineages, then examined by flow cytometry (FACS) after being incubated with PDS for 14 days. The results showed that the number of CD34+ cells was 1.0±0.15% out of marrow nuclear cells after being purified by Dynal beads system. The enrichment of CD34+ cells reached to 86.8±2.8 %. The best efficiency in promoting proliferation of CD34+ cells in vitro was obtained when the concentration of PDS was 25 mg/L, the formation of CFUMix colonies significantly increased by 56.3±3.5% over those of noPDS control (p<0.01). The results from suspension culture revealed that myeloid cells elevated in a dosedependent manner with a peak increasing rate of 35.6±3.2%, and erythroid cells significantly increased by 22.3±2.1% over those of noPDS control (all p<0.01). After incubation with PDS for 14 days, number of CD33+ cells increased in a dosedependent manner with a peak increasing rate at 50 mg/L. CD71+ cells reaching the peak were at 25 mg/L, while GA+ cells were increased by 7.2±1.3% (p<0.01) at 10 mg/L, but the number of CD15+ cells was not found to be changed before and after treating with PDS. It is concluded that PDS not only enhance the proliferation of CD34+ cells, but also induce differentiation of CD34+ cells toward to myeloid and erythroid lineages. PDS may play the roles as like hematopoietic growth factor, or provide synergistic effects on growth factor in the regulation of hematopoiesis.

　　Key words panaxadiol saponin; CD34+ cell; cell proliferation; cell differentiation

　　J Exp Hematol 2007; 15(4):776-779

　　人参作为抗衰老、强壮剂和补气血药物已有千余年历史。有关人参的各种生物学效应和活性研究已有较多报道，我们已报道了人参总皂苷及其单体对造血方面的研究[1-4]，但有关人参二醇(panaxadiol saponin, PDS)对CD34+细胞的研究未见报道。本研究采用吸附单克隆抗体免疫磁珠的方法从正常骨髓中分离获得CD34+ 细胞。用琼脂半固体培养观察PDS促进CD34+ 细胞形成多向祖细胞集落(CFUMix)的增殖活性;以液体培养和流式细胞术分析PDS对CD34+ 细胞的诱导分化效应，以确定PDS促进造血的有效性，为临床应用提供实验依据。

　　材料和方法

　　标本采集和CD34+ 细胞分离

　　取胸外科手术切除的肋骨(无血液系统疾病，骨髓象正常)。挤出骨髓液，用淋巴细胞分离液分离出有核细胞，计算骨髓有核细胞总数。CD34+ 细胞分离按照本室以前建立的方法进行[5]，采用吸附单克隆抗体—免疫磁珠分离系统(Dynal公司产品，挪威)，将骨髓细胞液加入免疫磁珠中，置冰浴中作用30分钟。弃去未结合磁珠的细胞。重复洗涤已附有CD34+ 细胞的免疫磁珠3次，吸取脱磁珠溶液0.1 ml加入含CD34+ 细胞的试管中，混匀置37℃水浴15分钟。吸取分离缓冲液洗涤分离后的CD34+ 细胞悬液3次。计算CD34+ 细胞总数，用台盼蓝染色测定细胞活力，并用CD34单克隆抗体作细胞表面标记,流式细胞仪检测CD34+ 细胞纯度、数量和质量。

　　研究用药

　　PDS干燥粉剂由浙江中医药大学附属第一医院中药研究室提供, 纯度为78%，用IMDM配成1 g/L的工作液,正压过滤除菌(膜孔径0.2 μm), 4℃保存备用。

　　半固体集落培养CD34+细胞的刺激增殖试验

　　多向祖细胞(CFUMix)培养体系按本室已建立的方法配制，含25%胎牛血清、1%牛血清白蛋白、青霉素和链霉素各100 U/ml、10-6 mmol/L 2巯基乙醇(2ME)、10 ng/ml白介素3(IL3)、2 U/ml红细胞生成素(EPO)、40 ng/ml粒单集落刺激因子(GMCSF)、3 ng/ml干细胞生长因子(SCF)和0.3%琼脂。骨髓细胞接种的浓度为1×105/ml;CD34+ 细胞浓度为1×104/ml。PDS用IMDM培养液配成所需浓度的工作液，加入CFUMix培养体系中，终浓度分别为0、5、10、25、50、100和200 mg/L。充分混匀后加入24孔培养板，每孔0.5 ml (4个复孔)。置于37℃、5% CO2培育箱中培养14天,计数CFUMix集落，标准为每个集落至少含100个细胞，由3个系列的血细胞组成。

　　液体培养CD34+细胞的增殖和分化试验

　　按本室建立的方法:①粒系细胞培养体系含25%胎牛血清、1%牛血清白蛋白、100 U/ml双抗、10-6 mol/L 2ME、3 ng/ml SCF、2 ng/ml IL3、3 ng/ml IL6、5ng/ml GMCSF。②红系细胞培养体系含25%胎牛血清、1%牛血清白蛋白、100 U/ml双抗、10-6 mol/L 2ME、3 ng/ml SCF、2 ng/ml IL3、3 ng/ml IL6、40 ng/ml EPO。每孔接种细胞数量均为2×104/ml。将培养板置于37℃、5% CO2培养箱中孵育14天，收集细胞，计数不同浓度PDS促进粒系、红系细胞增殖的提高率。③上述培养体系均加入不同浓度的PDS，终浓度分别为0、5、10、25、50和100 mg/L。

　　细胞分化的表面标志分析

　　CD34+细胞经上述方法培养14天后，选用针对粒系、红系细胞分化的单克隆抗体CD33+、CD15+、CD71+、GA+(DAKO公司产品，美国)作细胞表面标记。收集培养后的粒系、红系细胞，经PBS洗涤后制成细胞悬液[含(2-5)×105细胞]，每组分别加单克隆抗体各5 μl，粒系细胞加CD33和CD15抗体，红系细胞加CD71和GA抗体，同时加入IgG FITC或IgG PE作为流式细胞术检测的对照。将抗体与细胞在4℃孵育30分钟，洗去没有标记上的抗体，用双色流式细胞仪进行分析，每个样本分析104细胞。 分析软件为 Coulter 公司的产品， 型号是EPICSR XL。

　　统计学处理

　　多次实验数据以±SD表示，用t检验分析两组配对资料间的差异显著性。

　　结 果

　　骨髓CD34+ 细胞得率、纯度及活性

　　10份正常人骨髓标本，每份取108单个核细胞用来提取CD34+ 细胞，经免疫磁珠方法分离富集后，获得CD34+ 细胞数(1.00±0.15)×106/108个，占骨髓有核细胞的0.33%-1.49%，经流式细胞仪分析，CD34+细胞的富集度达(86.8±2.8)%(附图)，活细胞比率为94%-98.2%。

　　Figure. Purity of CD34+ cells isolated from human bone marrow by using Dynal CD34 Cell Selection System.

　　PDS对人骨髓细胞生成CFUMix集落的作用

　　骨髓细胞未经免疫磁珠分离而直接培养，结果显示不同浓度的PDS对骨髓CFUMix集落形成具有明显的刺激增殖作用，PDS浓度10-100 mg/L时，集落数均明显高于对照组 (p<0.01和0.05)，低浓度5 mg/L作用不明显，而高浓度200 mg/L也未见抑制生长现象。这些结果提示10-50 mg/L的PDS浓度是刺激骨髓细胞增殖的最佳浓度(表1)。

　　PDS促进CFUMix集落生成的作用

　　将免疫磁珠分离的CD34+ 细胞进行CFUMix集落培养，结果与骨髓细胞直接培养相似。表2显示PDS浓度10-100 mg/L时，集落数均明显高于对照组 (p<0.01和0.05)，低浓度5 mg/L作用不明显，而高浓度200 mg/L也未见抑制生长现象。此结果提示10-50 mg/L的PDS浓度是刺激CD34+ 细胞增殖的最佳浓度。PDS对CD34+ 细胞与骨髓细胞形成CFUMix集落的提高率分别为(56.3±3.5)%与(48.7±3.9)%，表明其刺激CD34+ 细胞增殖的作用较骨髓细胞更为显著。

　　PDS促进CD34+ 细胞生成粒系、红系细胞的作用

　　分别从10份正常人骨髓标本分离出CD34+ 细胞，每份标本分别进行粒系与红系细胞液体培养14天，结果显示，粒系培养组PDS 10-50 mg/L时获得细胞数为(34.1±3.0-37.2±3.3)×104，明显高于对照的(28.6±2.5)×104 (p均<0.01)。红系组PDS 10、25 mg/L时获得细胞数为(20.2±1.8)×104、(22.3±2.1)×104，均明显高于对照的(15.0±1.3)×104，(p均<0.01)(表3)。上述结果提示PDS 25 mg/L是液体培养促进CD34+ 细胞增殖的最佳效应点。

　　PDS对CD34+ 细胞的诱导分化作用

　　表4显示在液体培养中不同浓度的PDS诱导CD34+ 细胞定向分化，经14天培养细胞表面标记的变化。CD33+ 细胞数随PDS的浓度升高而增加，PDS浓度5-50 mg/L 时明显高于对照(p<0.01)，50 mg/L 达到高峰，而CD15+细胞数经PDS作用后无明显变化。CD71+ 细胞和GA+ 细胞在PDS浓度为10-25 mg/L时增加明显(p<0.05和<0.01)，GA+ 细胞数增高的幅度要大于CD71+ 细胞。这些结果表明PDS对CD34+ 细胞具有诱导定向分化的作用。

　　讨 论

　　血细胞按照发育阶段分为干细胞、祖细胞和成熟细胞。各类血细胞均来源于造血干细胞，而CD34抗原是造血干祖细胞表面的一种特征性标志[6,7]，造血组织中的绝大多数造血细胞都集中在CD34抗原阳性的细胞群体中[8]，本研究用免疫磁珠分离系统获得高纯度的人骨髓CD34+ 细胞，用来研究PDS对造血干细胞的增殖和分化作用。实验表明，PDS在液体培养体系中能诱导CD34+ 细胞增殖，并向粒系和红系细胞定向分化，与我们以前报道的人参皂苷对CD34+ 细胞增殖和分化作用相似[4]，说明PDS为人参总皂苷的促进造血的有效成份。

　　造血干细胞95%以上处于G0期，对细胞因子的反应较弱，而经细胞因子刺激进入细胞增殖周期，并大量增殖和分化的祖细胞，但又难以维持早期祖细胞的性能。周岐新等[9]报道，人参可促进G0期骨髓细胞进入增殖周期或缩短增殖周期时间。本研究表明，PDS是人参皂苷内刺激造血细胞增殖的有效成分。 10-25 mg/L PDS 对人骨髓 CD34+ 细胞体外扩增和分化作用显著，提示它具有类似生长因子样作用或协同效应。本实验室曾通过信号途经的研究探讨人参皂苷促进造血的机理，表明人参皂苷通过诱导GATA族转录调控蛋白合成增加，与基因上游调控区的启动子/增强子结合的活性增高，而调控与细胞增殖、分化相关基因的表达[2]。

　　利用CD34+ 细胞具有高度增殖能力和多向分化潜能的特性，在重组造血生长因子存在条件下进行体外扩增，造血祖细胞可增加数十倍[10]。本研究结果显示，PDS具有促进CD34+细胞增殖作用，半固体培养使CFUMix集落形成率增高，液体培养使红系、粒系细胞生成增多。为了观察PDS的诱导分化作用，采用不同的造血生长因子使CD34+ 细胞在体外分别向粒系、红系细胞定向分化，与此同时加入不同浓度PDS，结果表明PDS具有诱导CD34+ 细胞分化成粒系、红系细胞的作用，标记阳性细胞比例明显增高。上述结果提示PDS不但促进CD34+细胞增殖，而且能诱导其定向分化，具有类似造血生长因子和协同生长因子的效应。

　　【参考文献】

　　1高瑞兰，徐从连，金锦梅等.人参总皂甙对正常人和再生障碍性贫血患者造血祖细胞的刺激增殖作用.中国中西医结合杂志，1992;12：285-287

　　2高瑞兰，吴超群，BH Chong.人参皂甙诱导的造血细胞内信号传递途径的研究. 中华血液学杂志,1999;20：292-295

　　3牛泱平，金锦梅，高瑞兰等.人参皂甙Rg1和Rb1对骨髓粒巨噬系祖细胞增殖的作用.中国实验血液学杂志, 2001;9：178-179

　　4金锦梅， Tao Helen，高瑞兰等. 人参皂甙对CD34+干/祖细胞的增殖和分化作用.中国中西医结合杂志，2000;20：673-676

　　5钱煦岱，高瑞兰，马珂等.三七皂苷对人骨髓CD34+造血干细胞的增殖分化作用.中国实验血液学杂志,2003;11：120-123

　　6Kranse DS, Fackler MJ, Civin Cl, et al. CD34: Structure, bio1ogy, and clinical utility. Blood,1996; 87:1-13

　　7奚永志,李秀森,张双喜等. 人正常骨髓CD34+造血细胞的形态学与细胞化学特征.中华血液学杂志,1997;18:130-132

　　8裴雪涛,吴祖泽,Coutinho LH 等. 利用吸附单克隆抗体磁珠分离系统分离CD34+祖细胞.中华血液学杂志, 1995;16：270-271

　　9周歧新,韩锐. 人参总皂甙对小鼠骨髓造血干细胞的影响.中草药,1983;1：27-29

　　10裴雪涛，王立生，徐黎等. CD34+造血祖细胞的定向诱导分化研究.中华血液学杂志,1998;19：289-293