维生素K2诱导人骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ1细胞凋亡机制的研究

　　作者：陈宝安　　作者单位：东南大学附属中大医院血液科、骨髓增生异常综合征研究所， 南京 210009

　　【摘要】为了研究维生素K2(VK2)诱导人骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株MUTZ1细胞凋亡的作用机制, 采用流式细胞术AnnexinVFITC/PI双染分析细胞凋亡率和PI染色分析细胞周期的改变，用RTPCR技术检测抗凋亡基因bcl2、survivin和促凋亡基因bax的表达，用发光比色法检测caspase3活性。研究结果显示：细胞的凋亡率随着VK2浓度的增加和作用时间的延长逐渐增高并呈明显的时间浓度依赖性(P<0.05)，且随着药物浓度的增加和作用时间的延长S期和G2期细胞逐渐减少(P<0.05),G0/G1期细胞逐渐增多(P<0.01),细胞被阻滞在G0/G1期，并且在G0/G1期前出现明显的亚G1峰，即凋亡峰;抗凋亡基因bcl2、survivin的表达随着VK2浓度的增高明显下调(P<0.05)，而促凋亡基因bax表达无明显变化(P>0.05); caspase3的活性随着VK2浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增强。结论: VK2主要是通过激活caspase3途径诱导MUTZ1细胞发生凋亡，同时抗凋亡基因bcl2、survivin在细胞凋亡过程中也起重要作用。

　　【关键词】 维生素K2 骨髓增生异常综合征 MUTZ1细胞株 caspase3 细胞凋亡

　　Possible Mechanism Underlying Apoptotic Induction Effect of Vitamin K2 on Human MDS Cell Line MUTZ1 CHEN BaoAn, SHAO ZeYe, XIA GuoHua, XU Xin, DING JiaHua, GAO Chong , SUN YunYu，GAO XueZhi Department of Hematology, Affiliated Zhongda Hospital, Southeast University, Institute of Myelodysplastic Syndrome, Nanjing 210009, China

　　Abstract The study was aimed to investigate the possible mechanism of vitamin K2 (VK2) on myelodysplastic syndrome(MDS)cell line MUTZ1 in vitro. The flow cytometry was used to analyze apoptosis rate and the change of cell cycle. The expression of apoptosisrelated genes bcl2, survivin and bax were detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR). The activity of caspase3 was detected by chemiluminescence assay. The results indicated that the apoptosis peak on FCM and positive AnnexinV FITC on cell membrane showed that VK2 induced apoptosis of MUTZ1 cells in a doseandtimedependent manner, S and G2 cell decrement, G0/G1 cell arrest, VK2 significantly downregulated the expression of bcl2 and survivin, but had no effect on the expression of bax, the activity of caspase3 was significantly increased. It is concluded that VK2 induces apoptosis of MUTZ1 cells through activating caspase3 pathways and the apoptosisrelated genes bcl2 and survivin may play important roles in the process of apoptosis induction.

　　Key words vitamin K2; MDS MUTZ1 cell line; caspase3; apoptosis

　　J Exp Hematol 2007; 15(1):91-94

　　维生素K2(VK2)是天然的具有萘醌核结构VK2的化合物，具有凝血活性，临床作为止血药物已应用多年。近几年有关VK2的抗肿瘤作用日益受到重视。国外一些学者的体内外实验已经证明，VK2具有诱导多种肿瘤细胞凋亡的作用[1-7]，但其作用机制尚不完全明了。我们的前期研究已经证实，VK2能够诱导MDS细胞株MUTZ1细胞凋亡，本实验旨在探讨VK2对MUTZ1细胞株的作用机制，以期为临床选用VK2治疗MDS病人提供理论依据。

　　材料和方法

　　细胞系及培养

　　细胞株由德国Brauschweig细胞中心提供，MUTZ1是MDSRAEB细胞系，免疫表型显示前B细胞的表面标记(CD10+，CD19+，cyIgM+)，染色体核型表现为高频率的染色单体断裂、交换、及缺失等。MUTZ1细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于5% CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

　　RPMI 1640培养液购自Gibco公司;胎牛血清为杭州四季清产品。VK2为Sigma公司产品，用无水乙醇配成浓度为10-2mol /L的储存液，20℃避光保存，用时用培养液稀释成所需要的浓度。实验证明所用药物浓度的乙醇含量对细胞生长无影响。细胞周期检测试剂盒和AnnexinVFITC凋亡试剂盒购自Becton Dickinson公 司。RTPCR引物由上海生工生物工程公司合成;总RNA提取试剂盒购自Promega公司;caspase3试剂盒购自凯基生物工程公司。

　　AnnexinVFITC/PI双染色和细胞周期检测

　　取对数生长期细胞(1×105/ml)，接种于6孔培养板，然后分别加入不同浓度的VK2(0、5、10、20和40 μmol/ L),孵育后分别于24、48、72和96小时收集细胞，用流式细胞分析仪分析，分别按试剂盒说明检测细胞凋亡率和细胞增殖周期。

　　Caspase3活性的免疫荧光比色法检测

　　取对数生长期的细胞(1×105/ml)，试验组加入不同浓度的VK2，对照组不加药，培养72小时后收集细胞，用PBS洗涤，以冷的lysis buffer悬浮细胞，置冰上20分钟,4℃，11 000×g离心3分钟,测定上清蛋白浓度，吸取50 μl含50-200 μg蛋白的细胞裂解液上清，加入50 μl reaction buffer,再加入5 μl caspase3 substrate并于37℃避光孵育4 小时,用酶标仪(405 nm)测定吸光度，与对照组进行比较观察caspase3活化程度。

　　凋亡抑制基因bcl2、survivin及促凋亡基因bax mRNA表达的RTPCR半定量检测

　　引物序列 由上海生工生物工程公司合成。survivin(439 bp) F: 5'CTTTCTCAAGGACCACCGCATC3', R: 5'AAGTGGTGCAGCCACTCTGGG3'; bax: (258 bp) F: 5'ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC3', R: 5'TGTCCAGCCGCATGATGGTTC3'; bcl2(326 bp) F: 5'GACTTCGCCGAGATGTCCA3', R: 5'GTCTTGAGAGACAGCCAGGA3'; GAPDH(内对照379 bp) F: 5'TCCCATCACCATCTTCCA3', R: 5'CATCACGCCACAGTTTCC3'

　　总RNA抽提 按Promega公司提供的试剂盒建议的步骤操作。

　　RTPCR 逆转录反应体系20 μl，42℃逆转录1 小时; 50 μl PCR反应体系中含有4 μl逆转录反应产物，内对照引物和基因特异性引物各20 pmol, TaqDNA聚合酶0.5 μl (2.5 U)。 反应在DNA扩增仪上进行： 95℃加热预变性后，按94℃ 45秒;58℃ 1分钟;72℃ 1分钟进行35个循环，最后在72℃延伸7分钟。(survivin 引物退火温度61℃);然后取5 μl PCR产物，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用EDAS120凝胶电泳分析系统对电泳条带进行光密度分析。

　　统计学处理

　　应用SPSS 11.5统计软件进行统计，统计分析实验数据用(±SD)表示，采用两因素方差分析和q检验分析整体差异;应用t检验分析实验组和对照组之间的差异;用直线回归计算IC50值;以P﹤0.05为差异具有显著意义。

　　结 果

　　AnnexinVFITC/PI双染色检测的细胞凋亡率

　　结果表明，随着VK2浓度的增加和作用时间的延长细胞的凋亡率逐渐增加，且呈明显的浓度时间依赖性,与对照组相比有显著差异(P< 0.01)(表1) 。

　　VK2作用后MUTZ1细胞周期的改变

　　MUTZ1细胞经VK2处理后细胞发生凋亡,凋亡后形成凋亡小体，导致细胞的DNA丢失，在流式细胞仪检测的DNA含量图中，在G1期细胞前出现亚G1峰，即凋亡峰。随VK2浓度的增加和作用时间的延长细胞的凋亡率明显增高，且G0/G1期细胞逐渐增加与对照组相比有显著差异(P﹤0.01)、S期和G2/M期细胞逐渐减少(P﹤0.05)，细胞被阻滞在G0/G1期(图1)。

　　Figure 1. Cell cycle change of MUTZ-1 treated by VK2. A: Untreated MUTZ-1 cells cycle. B: MUTZ-1 cells treated by 40 μmol /L VK2 for 72 hours. AP: apoptosis peak

　　VK2对MUTZ1细胞caspase3活性的影响

　　经5 μmol/L VK2处理后细胞的caspase3活性与对照组相比有下降趋势，但无统计学意义;经10 μmol/L以上浓度的VK2处理后，随VK2浓度增加和作用时间的延长，caspase3活性明显增强并呈浓度时间依赖性，与对照组相比有明显差异(P﹤0.05)( 图2)。

　　Figure 2. Activity change of caspase3 of MUTZ-1 cells after treatment with different concentrations VK2. a: P<0.05, compared with control. b： P<0.01, compared with control; P<0.05, compared with 10 μmol/L. c： P<0.01, compared with control; P<0.01, compared with 20 μmol/L.

　　RTPCR检测结果

　　经不同浓度的VK2处理72小时后，与对照组相比，凋亡抑制基因survivin、bcl2随VK2浓度增加而明显下调，与对照组相比有显著差异(P﹤0.05);而促凋亡基因bax无明显改变(P>0.05)(图3)。

　　Figure 3. mRNA expression of bcl-2, survivin and bax on MUTZ-1 cells treated by VK2 for 72 hours.

　　讨 论

　　VK2主要通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增殖，这已被多项实验研究所证实[1~7]。特别是近几年国外有报道，VK2能选择性地诱导白血病细胞凋亡,而对正常骨髓细胞只有微弱的抑制作用，且临床副作用较少[5、6、7.11]，这些引起人们的关注，但具作用机制还未完全明了，且国内鲜见相关报道。

　　本实验结果表明，MUTZ1细胞经VK2作用后生长明显受到抑制;流式细胞仪分析结果显示，随着VK2的浓度增加和作用时间的延长细胞的凋亡率逐渐增高且呈明显的量效和时效关系;细胞周期分析结果表明，随着VK2浓度的增加，S期和G2/M期细胞逐渐下降，G0/G1期细胞逐渐增多，显示细胞被阻滞在G0/G1期;进一步研究发现，caspase3增加，且具有浓度时间依赖性，这表明此途径可能是VK2诱导MUTZ1细胞凋亡的主要途径之一。

　　Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族(inhibitor of apoptosis protein, IAP)成员，在多种恶性肿瘤细胞中都高表达[8]，而且具有明显的细胞周期依赖性，在G2/M期表达最高，S期次之，G1期表达则迅速下降[9]。在细胞周期阻滞中，VK2在细胞翻译过程中激活P21蛋白，后者能结合并阻止G1周期蛋白依赖性激酶的磷酸化，结果导致细胞在G0/G1期被阻滞[1]。本实验表明， VK2处理MUTZ1细胞株后细胞被阻滞在G0/G1期，同时survivin基因表达逐步下降，这与以上的研究结果相一致。

　　实验中发现，随着VK2浓度的增加bcl2表达下降，bax基因表达无明显变化。bax是bcl2相关的基因，它与 bcl2构成同源或异源二聚体形成的调节是细胞凋亡调控中一个非常重要的环节。有研究表明，氧自由基能够启动NFκB的表达，从而通过其抑制抗凋亡基因bcl2的表达使得bcl2/bax比例下降，损伤线粒体，导致细胞死亡[10]。VK2自身拥有萘醌核结构，和其他含有醌类结构的化疗药物一样具有行氧化还原的作用，可产生自由基和活性氧，从而抑制肿瘤生长。

　　Nishimaki等[6]于1999年研究发现，VK2导致MDS/RAEBT细胞株的凋亡与细胞线粒体膜电位改变有关，即改变了其渗透性(PT);这种改变可被bcl2表达产物所阻止，但并不被caspase抑制子所阻断。他们认为，VK2处理细胞后可下调bcl2，上调促凋亡因子bax，因此凋亡是通过caspas3途径使得线粒体功能丧失所致。Miyazawa等[4]亦认为，VK2诱导细胞凋亡是通过caspase3途径。这与我们以上的研究也是相吻合的。

　　另外，实验中还发现：低浓度(5 μmol/L)的VK2有促进细胞增生的趋势，使得survivin基因表达增高、caspase3活性下降，但诱导分化现象并不显著，无统计学意义。

　　综上所述，对于MUTZ1细胞株，VK2可能通过激活caspase3途径诱导细胞凋亡而抑制其增殖的，并且具有剂量和时间依赖性，同时抗凋亡基因survivin、bcl2下调在细胞发生凋亡的调控过程中也起了重要的作用。鉴于VK2可使细胞阻滞在G0/G1期，还可与其他药物联合用于临床治疗，而且对正常骨髓细胞影响甚小，因此可以预见，VK2在治疗MDS中有光明的临床应用前景。

　　【参考文献】

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　　4Miyazawa K, Yaguchi M, Funato K, et al. Apoptosis/ differentiation inducing effects of vitamin K2 on HL60 cells: dichotomous nature of vitamin K2 in leukemia cells. Leukemia, 2001; 15:1111-1117

　　5Abe Y, Muta K, Hirase N, et al. Vitamin K2 therapy for myelodysplastic syndrome. Rinsho Ketsueki, 2002; 43:117-121

　　6Nishimaki J, Miyazawa K, Yaguchi M, et al. Vitamin K2 induces apoptosis of a novel cell line established from a patient with myelodysplastic syndrome in blastic transformation. Leukemia, 1999;13:1399-1405

　　7Yaguchi M, Miyaza K, Katagiri T , et al. Vitamin K2 and its derivatives induce apoptosis in leukemia cells and enhance the effect of alltrans retinoic acid. Leukemia,1997; 11:779-787

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　　11Yaguchi M, Miyazawa K, Otawa M, et al. Vitamin K2 selectively induces apoptosis of blastic cells in myelodysplastic syndrome: flow cytometric detection of apoptotic cells using APO2.7 monoclonal antibody. Leukemia,1998; 12:1392-1397