液相杂交检测B细胞淋巴瘤细胞系miR-28的表达

　　作者：徐卫,李建勇,陆凤翔　　作者单位：南京医科大学第一附属医院血液科，南京 210029

　　【摘要】microRNA (miRNA)是一组在进化上高度保守、非编码蛋白、参与转录后调节的小分子RNA(19-25核苷酸)。为了进一步明确miRNA的加工机制及功能和定量研究miRNA的表达水平，应用液相杂交和Northern blot两种方法检测miR-28在B细胞淋巴瘤细胞系中的表达并进行了比较。结果表明：液相杂交和Northern blot检测miR-28均显出阳性结果，但液相杂交所用的细胞总RNA量(5 μg)明显少于Northern blot(30 μg)，液相杂交的条带信号也较Northern blot的强。结论：液相杂交是一种较Northern blot更为快速、简便和敏感的检测miR-28的方法。

　　【关键词】 淋巴瘤

　　Abstract microRNA (miRNA) is evolutionarily conserved，non-coding small RNA (19-25 nt) involved in post-transcriptional gene regulation.To further understand the biogenesis and functions of miRNA，and to quantify miRNA expression levels，the expression of miR-28 in B lymphoma cell lines was detected by solution hybridization and Northern blot，and their detected results were compared.The results indicated that detection of miR-28 by solution hybridization and Northern blot showed positive，but total RNA amount used for solution hybridization detection was significantly lower than that for Northern blot detection (5 μg vs 30 μg)，signal of solution hybridization was stronger than that of Northern blot.It is concluded that the solution hybridization for detection of miR-28 in B cell lymphoma cell lines is a faster and more sensitive method as compared with standard Northern blot technique.

　　Key words solution hybridization; Northern blot; miRNA; lymphoma; miR-28

　　microRNA(miRNA)是一种大小约19-25个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过切酶(dicer)加工后生成[1]。miRNA在线虫、果蝇、小鼠和人等多个物种中被广泛发现，而且在进化上高度保守，在人类已经发现有222个 miRNA。目前对miRNA的研究不断深入，并认为这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。

　　由于miRNA是一类很小的分子，它的表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究非常困难，目前研究人员多采用Northern blot方法来检测miRNA的存在[2]。传统的Northern blot方法是用探针检测固相支持物(膜)上的目标分子，由于用探针检测液相中的目标分子远比检测固相中的目标更为灵敏，本研究采用液相杂交(solution hybridization)的方法检测4种B细胞淋巴瘤细胞系中miR-28的表达。miR-28基因是22个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的86个碱基的单链RNA前体经过切酶加工后生成，位于染色体3q27-28的含LIM的脂肪瘤多见融合伙伴(LIM-containing lipoma preferred partner，LPP )基因中。

　　材料和方法

　　细胞系

　　B细胞淋巴瘤细胞系HRC57、RCK8、BEVA和OCL-LY8，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃、5% CO2及恒定湿度条件下培养。

　　细胞总RNA的提取

　　总RNA提取

　　采用TRIzoL试剂(Life technologies公司)进行RNA一步法提取。取对数生长期细胞1×107，经预冷的PBS 洗涤，移入离心管中，加入1 ml TRIzoL，混匀，室温静置15分钟;加入0.2 ml氯仿，振荡15秒，静置3分钟;4℃、12 000×g离心15分钟，取上清;加入0.5 ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟 ;4℃、12 000×g离心10分钟，弃上清;加1 ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀;4℃、7 500×g离心5分离，弃上清;风干，加入适量的DEPC H2O溶解;-80 ℃保存备用。

　　RNA定量

　　取适当稀释的RNA样品，分别在紫外分光光度计260 nm 和280 nm 波长下读数，按1 OD值40 g/ L RNA 计算RNA 的含量。

　　miR-28探针制备

　　采用mirVanaTM miRNA Probe Construction Kit(Ambion公司)制备探针。miR-28的序列为：5′AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG 3′。设计miR-28探针为：在3′端另外增加8个和T7启动子互补的碱基5′CCTGTCTC 3′，将这段寡核苷酸和T7启动子引物退火，用Klenow DNA聚合酶，于37℃作用30分钟，将大片段补齐得到双链DNA转录模版，然后与T7 RNA聚合酶、rNTP和标记物([α-32P]UTP)混合，体外37℃作用30分钟，转录得到标记的小分子miR-28探针5′ GAGACAGGCUCAAUAGACUGUGAGCUCCUU 3′;DNase Ⅰ于37℃，作用10分钟消化多余的双链DNA转录模版。具体操作参照产品说明书进行。

　　Northern blot

　　RNA电泳

　　首先制备15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶，在离心管中混合待测细胞系总RNA (30 μg)和加样缓冲液(5 μl)，95-100℃变性3分钟，立即置冰浴，加样，恒流(20 mA)进行电泳，分离分子量大小不同的RNA。待溴酚蓝移至胶长的2/3时中止电泳，紫外灯下观察RNA质量。

　　转膜

　　用半干转移法(semi-dry transfer)将RNA从变性胶转移到Hybond尼龙膜上(Amersham Biosciences公司)(200 mA，30分钟)，UV 交联。

　　预杂交 将膜的反面紧贴杂交瓶，加入杂交液(Amersham Biosciences公司)10 ml，42℃预杂交3小时。

　　杂交

　　将变性的同位素标记的miR-28探针(95-100℃变性5分钟，冰浴5分钟)20 μl加入到杂交液中，42℃杂交4小时或过夜。

　　洗膜

　　倾去杂交液，用2×SSC/0.1%SDS/DEPC水，42℃洗20分钟，2次;再用1×SSC/0.1%SDS/DEPC水，42℃洗20分钟，2次。

　　显影

　　用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-80℃放射自显影2-3天左右检测结果。

　　液相杂交

　　用mirVanaTM miRNA Detection Kit(Ambion公司)进行，首先将同位素标记的miR-28小分子探针进行凝胶纯化(gel purification)，然后与待检测细胞系总RNA (5 μg)混合，95-100℃变性3分钟后于42℃杂交2小时或过夜。基于核酶保护分析方法，用单链核酸酶RNase A/T1消化未杂交的RNA和多余的探针，于37℃作用1小时。然后用RNase/PPT溶液225 μl使核酸酶失活，并加等量的100%乙醇，于-20℃条件下，作用30分钟沉淀杂交的RNA分子，4℃、12 000×g离心15分钟，弃上清，风干10分钟，与加样缓冲液5 μl混合，95-100℃变性3分钟，加样于15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶，恒流(20 mA)电泳至待溴酚蓝移至胶长的2/3 时停止，用薄型塑料纸将凝胶包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-80℃放射自显影1-2天检测结果。具体操作参照产品说明书进行。

　　结 果

　　细胞总RNA提取

　　用本方法所提取的细胞总RNA 的D (260)/D (280) 和D (260)/D (230) 都在2.0 左右，说明RNA 样品未受到蛋白质、苯酚和碳水化合物的污染。RNA 电泳时18 S 和28 S rRNA 的条带清晰，无拖尾现象，说明RNA 的纯度和完整性都很好。

　　miR-28探针制备

　　用mirVanaTM miRNA Probe Construction Kit制备的探针经15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影，在30个碱基处可见明显清晰的条带，说明探针标记良好。

　　Northern blot和液相杂交两种方法检测miR-28的结果比较

　　从附图中可以看出：miR-28在HRC57、RCK8、BEVA和OCL-LY8细胞系中的表达是不一致的。Northern blot和液相杂交两种方法均检出阳性结果;液相杂交所用细胞总RNA为5 μg，Northern blot为30 μg，而液相杂交结果条带信号较更强，说明液相杂交检测miR-28较Northern blot方法敏感。

　　讨 论

　　RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡阶段”，但越来越多的证据表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们先前设想的更为重要。RNA干扰(RNA interference)的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化或替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意。miRNA是一种大小19-25 nt的单链小分子RNA，最早被确认的miRNA是在线虫中的lin-4 [3]和let-7[1，4]，到目前为止已经有将近1 400个miRNA在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中被报道。随着对这些miRNA 的基因序列、加工表达方式、生理功能等方面日益深入研究发现，miRNA发挥着非常重要的基因表达调节作用，可以从一种全新的角度来认识基因及其表达调节的本质。2002 年美国《科学》杂志评出的年度十大科技突破中，miRNA 的发现名列榜首。

　　近年来，miRNA在恶性疾病中的作用引起很大的关注，认为miRNA在肿瘤发病中起重要作用[5]。Calin等[6]研究发现，50%以上的miRNA基因定位于与肿瘤相关的区域或脆性区域。在恶性淋巴增殖性疾病中，miRNA直接参与染色体的缺失，大约50%的CLL中有染色体13q14的缺失，miR-15和miR-16基因定位于染色体的13q14位置上，在慢性淋巴细胞白血病(CLL)病人中发现这2个基因的表达有缺失或下调现象存在[2]。Eis等[7]研究发现，在一些B细胞淋巴瘤，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中miR-155的拷贝数较正常循环中B细胞高10-30倍。活化B细胞型DLBCL的miR-155拷贝数明显高于生发中心型DLBCL，且前者具有较差的预后，故认为miR-155的表达量可以作为B细胞淋巴瘤的诊断和预后指标。Calin等[8]运用基因芯片技术对CLL样本中数百个miRNA前体和miRNA进行检测，根据结果将CLL分为两组，且与CLL疾病状态和ZAP-70的表达有关，认为miRNA的表达与此类白血病的生物学和临床行为密切相关。

　　由于miRNA可能参与分化[9]、发育[10]、组织生长[11]、脂肪代谢[12]等生理过程，在不同的组织和发育阶段的表达水平有所不同，进一步了解miRNA的生物功能需要确定其在各种生物样品中的表达水平，因而需要一种精确的定量纯化方法，以便得到可信的数据。随着miRNA日益收受到研究人员的重视，很多研究miRNA的新方法不断推出。

　　miRNA探针的制备方法比较简单，只需要准备目的基因的一小段寡核苷酸序列，3′端另外增加8个和T7启动子互补的碱基，与T7启动子引物退火，用Klenow聚合酶得到双链的转录模板，然后用T7 RNA聚合酶、rNTP和标记物混合，体外转录得到标记的miRNA探针。这种方法可以快速制备各种标记(同位素、非放射性)的小于100核苷酸的miRNA探针，适用于包括液相杂交，Northern blot和原位杂交等各种方法检测核内小仁RNA( small nuclear RNA，snRNA)、小干扰RNA (siRNA)、miRNA和mRNA。非放射性标记的探针还可以用于原位杂交研究miRNA或者mRNA在组织中的分布。

　　本研究运用的基于核酶保护分析的液相杂交方法，将同位素标记好的miRNA探针和待检测样品进行混合杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，杂交的RNA分子最后通过变性胶电泳放射自显影检测结果。此方法不但操作简单快速，而且灵敏度极高——可以半定量检测少至10 ng总RNA模板中的miRNA，或者说，可以检测阿托摩尔(attomole即10-18 mol)级的靶目标，灵敏度是Northern blot的100倍，还可以在同一个样品中同时检测多个miRNA和长的RNA模板，为从事miRNA实验研究带来方便。

　　此外，现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA(200核苷酸以上)，miRNA往往被淘汰掉，因而不适用于miRNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留miRNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。而采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter，GFF)，既能够有效富集10 mer以上的RNA分子，又能够兼备离心柱快速离心纯化的优点，这是一个很好的选择。对于特别稀有的分子，由于需要分离大量RNA而导致高背景而降低灵敏度，还可以进一步富集10 mer到200 bp的miRNA来提高灵敏度。

　　【参考文献】

　　1 Ambros V，Bartel B，Bartel DP，et al.A uniform system for microRNA annotation. RNA，2003; 9: 277-279

　　2 Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.Proc Natl Acad Sci USA，2002; 99: 15524-15529

　　3 Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 RNA.Cell，1993; 75: 843-854

　　4 Lee RC，Ambros V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans.Science，2001; 294(5543): 862-864

　　5 McManus MT. MicroRNAs and cancer.Semin Cancer Biol，2003; 13: 253-258

　　6 Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers.Proc Natl Acad Sci USA，2004; 101: 2999-3004

　　7 Eis PS，Tam W，Sun L，et al. Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas.Proc Natl Acad Sci USA，2005; 102: 3627-3632

　　8 Calin GA，Liu CG，Sevignani C，et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.Proc Natl Acad Sci USA.2004; 101: 11755-11760

　　9 Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation.Science，2004; 303(5654): 83-86

　　10 Ruvkun G.Molecular biology.Glimpse of a tiny RNA world.Science，2001; 294(5543): 797-799

　　11 Johnston RJ，Hobert O.A microRNA controlling left/ right neuronal asymmetry in Caenorhabditis elegans.Nature，2003; 426(6968): 845-849

　　12 Xu P，Vernooy SY，Guo M，et al.The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.Curr Biol，2003; 13: 790-795