鱼藤素对K562细胞nup98表达的影响

　　作者：吴秋玲　　作者单位：华中科技大学同济医学院协和医院血液科，武汉 430022

　　【摘要】本研究观察鱼藤素对白血病细胞株K562细胞核孔蛋白nup98表达的影响。 用MTT比色法检测细胞增殖活性;流式细胞术及RTPCR法分析鱼藤素作用K562细胞后nup98蛋白及mRNA含量的变化。结果表明：鱼藤素能显著抑制K562细胞的增殖，并与作用时间和鱼藤素浓度呈依赖关系;空白对照组K562细胞nup98蛋白表达的平均荧光强度为34.22±1.63,显著高于阴性对照组(2.83±0.02，P<0.01)，10 nmol/L鱼藤素即能显著抑制nup98蛋白的表达;10 nmol/L鱼藤素对nup98 mRNA表达的抑制作用不显著，20、40、80、160 nmol/L鱼藤素能显著抑制nup98 mRNA的表达，并且呈剂量依赖性。结论：鱼藤素可通过抑制核孔蛋白nup98的表达进一步抑制K562细胞的增殖。nup98可能成为急性白血病治疗的基因靶点。

　　【关键词】 鱼藤素 K562细胞 nup98

　　Effect of Deguelin on Expression of nup98 in K562 Cells WU QiuLing， CHEN Yan， CHEN WeiHua， HE Jing Institute of Hematology, Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China

　　Abstract The study was purposed to investigate the effect of deguelin on expression of nucleoporin 98(nup98) in leukemia K562 cells. MTT assay was used to assess the effects of deguelin on cell proliferation. FCM and RTPCR were used to analyze the changes of nup98 mRNA and protein in K562 cells after treating with deguelin. The results showed that deguelin inhibited the proliferation of K562 cells in a time and dosedependent manner; mean fluorescence intensity of nup98 in blank group (34.22±1.63) was significantly higher than that in control group(2.83±0.02，P<0.01), 10 nmol/L deguelin could significantly inhibit the expression of nup98 protein; 10 nmol/L could not inhibit the expression of nup98 mRNA, 20, 40, 80,160 nmol/L deguelin could significantly inhibit the expression of nup98 mRNA in a dosedependant manner. It is concluded that deguelin inhibits the proliferation of K562 cell through inhibiting the expression of nup98, and may be considered as a new target for therapy of acute leukemia.

　　Key words deguelin; K562 cell; nucleoporin98

　　J Exp Hematol 2007; 15(1):25-28

　　急性白血病是一类造血克隆恶性变的异质性疾病，发病机制复杂，针对目前的发病机制采取的治疗措施疗效并不令人满意，探索新的发病机制成为学者们研究的重点。核孔蛋白是近年来研究发现的贯穿细胞核膜的一个重要双向通道，在调控核内外蛋白的转运过程中起重要作用，位于核内的蛋白质在胞浆合成后经核孔蛋白输入胞核，而tRNA、rRNA和mRNA则需要从细胞核经核孔蛋白输出至胞浆[1]。多种核孔蛋白参与调节增殖、凋亡、细胞周期、细胞分化、组蛋白乙酰化/去乙酰化平衡等多种途径中的关键蛋白的“核浆穿梭” 并进一步调控相应作用通路[2-5]，在恶性肿瘤的发病中起重要作用，其中核孔蛋白98 (nucleoprotein98, nup98)是目前研究中与急性白血病发病关系最密切的核孔蛋白，但其具体作用尚未见报道。

　　近年来中药鱼藤素的抗肿瘤作用备受人们关注，鱼藤素是从植物鱼藤酮中提取的一种新型的强有力的潜在抗癌药物，对多种进展期肿瘤有治疗作用[6,7]。本研究通过观察鱼藤素对K562细胞nup98表达的调节来探讨nup98在急性白血病发病中的作用及其调控机制。

　　材料和方法

　　细胞

　　人急性白血病细胞系K562细胞株由同济医科大学免疫教研室提供。

　　药物及主要试剂

　　鱼藤素(分子式为C23H22O6, 分子量为394.4,纯度99%),购自Sigma公司,溶解于二甲亚砜(DMSO)中,配成10 nmol/L溶液,等量分装, 置于-20℃保存,临用前解冻。MTT购自Sigma公司,羊抗人nup98多克隆抗体购自Biolegend公司;异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗羊荧光抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司;RNA抽提试剂TRIzoL购自Gibco公司，氯仿、异戊醇、乙醇为国产分析纯。RTPCR试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，引物由上海森工生物技术公司合成。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(1)鱼藤素对K562细胞nup98表达的影响细胞培养及处理

　　K562细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃，5% CO2和饱和湿度条件下培养，每3天更换新培养液，取对数生长期细胞，使细胞悬液终浓度为1×106/ml。K562细胞与不同浓度鱼藤素作用后，用MTT法检测鱼藤素对K562细胞增殖的影响，用流式细胞术和RTPCR方法检测nup98蛋白和mRNA水平的变化。

　　细胞增殖的MTT比色法测定

　　将处于对数生长期的K562细胞(2×105/ml)接种于96孔板,每孔200 μl,经不同浓度鱼藤素处理24-72小时后,加入5 mg/ml MTT 20 μl,继续孵育4小时,弃去孔内培养液,加入150 μl DMSO,振荡使结晶溶解后于490 nm波长酶标仪测定各孔光密度(OD)值。

　　增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/

　　对照组OD值)×100%

　　nup98 mRNA含量的RTPCR检测

　　RT-PCR 取5 μg作逆转录模板，按说明书合成cDNA第一链。 RT反应液的组成：25 mmol/L MgCl2 4 μl，10×buffer 2 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，Ribolock 1 μl，ALV 逆转录酶 (500 U/μl) 1 μl，随机引物1 μl，RNA sample 2 μl，DEPC H2O 9 μl; 按以下条件进行RT反应：70℃ 5分钟，25℃ 5分钟 ，25℃ 10分钟，42℃ 1小时，70℃ 10分钟 ，-20℃保存。以细胞cDNA的第一链为模板，作25 μl的PCR。PCR反应液的组成：10×buffer 2.5 μl，MgCl2 2.0 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，Taq 酶 0.5 μl，cDNA 2.0 μl，ddH2O 15 μl，引物1(5 pmol/μl)1.0×2 μl，引物2(5 pmol/μl)1.0×2 μl;混匀后，短暂离心，进行PCR反应。PCR扩增条件为：94℃ 5分钟，94℃变性 30秒，60℃复性 1分钟，共进行10个循环。94℃ 30秒，53℃复性 30秒，72℃延伸 30秒，共进行25个循环。最后72℃延伸7分钟，4℃保存。

　　PCR产物的电泳分析 取PCR产物8 μl作1.7%的琼脂糖凝胶电泳。nup98引物序列为：上游引物:5′ CTAGCAACAATACTGGAGGC3′，下游引物:5′CC TGAATTAGTGGTGGAGGA3′，扩增产物612 bp。βactin引物序列:上游引物:5′TGAGACCTTCAAC ACCCCAG3′，下游引物: 5′ GCCATCTCTTGCTCG AAGTC3′,扩增产物312 bp。用灰度扫描分析，结果用 5个样本的平均相对单位nup98 /βactin表示。

　　nup98蛋白表达的流式细胞术检测

　　调整细胞浓度为1×106/ml，不同组细胞处理后置37℃、5% CO2孵箱中培养24小时。离心收集细胞，PBS洗2次，加入羊抗人nup98稀释一抗(1∶50), 4℃孵育过夜, PBS洗1次，滴加FITC标记鼠抗羊稀释二抗(1∶50)，37℃孵育60分钟，PBS洗1次，500 μl PBS重悬，上流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司产品)检测。

　　统计学分析

　　所有数据均以均数±标准差(±SD)表示，采用SPSS 11.0软件包进行数据分析并t检验。

　　结 果

　　鱼藤素对K562细胞增殖的影响

　　用20 nmol/L鱼藤素分别作用于K562细胞24、48和72小时，结果显示鱼藤素作用24小时即可显著抑制K562细胞的增殖(细胞抑制率为35.71%)，随着时间的延长，鱼藤素对K562细胞的抑制效应增强(图1)。细胞经不同浓度的鱼藤素处理24小时，10 nmol/L鱼藤素的细胞增殖抑制率仅为16.7%，20、40和80 nmol/L鱼藤素组与10 nmol/L鱼藤素

　　Figure 1. Effect of 20 nmol/L deguelin on inhibition rate of proliferation of K562 cells freated for different time相比较，均有显著性差异(P<0.01)，并且呈明显的剂量依赖性(图2)。

　　Figure 2. Effect of deguelin at different concentration on inhibition rate of proliferation of K562 cells treated for 24 hours

　　鱼藤素对K562细胞nup98蛋白表达的影响

　　空白对照组K562细胞nup98蛋白表达的平均荧光强度为34.22±1.63,显著高于阴性对照组的2.83±0.02(P<0.01)，10 nmol/L鱼藤素组平均荧光强度为22.37±1.25，该浓度鱼藤素即能显著抑制nup98蛋白的表达。随着鱼藤素浓度的增加，nup98蛋白的表达逐渐降低，但20、40和80 nmol/L鱼藤素组平均荧光强度与10 nmol/L鱼藤素组相比无显著性差异，160 nmol/L鱼藤素组平均荧光强度显著低于10 nmol/L鱼藤素组(P<0.05)(图3)。

　　Figure 3. Effect of deguelin at different concentration on the expression of nup98 protein. *P<0.01, compared with control group ; **P<0.01, compared with blank group.

　　鱼藤素对K562细胞nup98 mRNA表达的影响

　　结果显示，10 nmol/L鱼藤素作用组nup98 mRNA表达略低于空白对照组(P>0.05)，20、40、80、160nmol/L鱼藤素处理组nup98/βactin值分别为0.63±0.03、 0.46±0.02、0.22 ±0.01、0.13±0.01，显著低于空白对照组(0.89±0.04，P<0.05)，随着鱼藤素浓度的增加，nup98 mRNA的表达逐渐降低，呈明显的剂量依赖性(图4，5)。

　　讨 论

　　研究发现，核孔蛋白N末端FG重复序列的异常与急性白血病发病关系密切，在许多急性白血病尤其是拓扑异构酶抑制剂相关性急性髓系白血病中可检测到与核孔蛋白有关的染色体易位、融合基因及转录产物[8]。Nishiyama等[9]对81例治疗相关的儿童AML、MDS进行了研究,发现5例(6%)11p15异常,并且证明全部与nup98基因有关。nup98HOXA9融合蛋白还具有转录激活和转化NIH3T3细胞的能力。用表达nup98HOXA9融合基因的造血干细胞重建小鼠的造血系统，小鼠会发生骨髓增殖性疾病并最终演变为急性髓性白血病[10]。将nup98HOXA9基因融合进BCR/ABL阳性的CML细胞，让二者共表达基因产物，结果7-10天内小鼠发展成急性白血病[11]。本试验结果发现，nup98蛋白在K562细胞中高表达，这表明nup98基因可能是白血病治疗的靶标之一，nup98在急性白血病发病中的具体功能尚需进一步的研究。

　　鱼藤素是从豆科家族绢毛萌豆(Mundulea sericea)中提取的一种高效低毒的新型化疗预防药物，纳摩尔浓度级鱼藤素即能显著抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖，并且对正常细胞的毒副作用小[6,7]。我们的实验也发现，鱼藤素能显著抑制K562细胞的增殖，并且与作用时间和鱼藤素浓度呈依赖关系。Liu等[12]发现，鱼藤素可诱导人类Burkitt淋巴瘤Daudi 细胞凋亡，促进Daudi 细胞阻滞于G1/S期，下调 cyclin D1和pRb的表达。鱼藤素还可抑制PI3K活性，降低pAKt的表达及调节COX2 的表达[13,14]，但鱼藤素对核孔蛋白的作用尚未见报道。我们采用流式细胞术研究发现，10 nmol/L鱼藤素即能显著抑制nup98蛋白的表达，20、40和80 nmol/L鱼藤素与10 nmol/L鱼藤素相比无显著性差异。而RTPCR结果显示，10 nmol/L鱼藤素对nup98 mRNA表达的抑制作用不显著，20、40、80、160 nmol/L鱼藤素能显著抑制nup98 mRNA表达并且呈明显的剂量依赖性，与流式细胞术检测结果略有不同，这说明mRNA和蛋白水平nup98对鱼藤素的反应不太一样，但总的说来鱼藤素能抑制nup98的表达。这一结果为鱼藤素的临床应用提供了新的实验依据。

　　【参考文献】

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