环孢菌素A、雷洛昔芬及其联合应用逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

　　作者：鲍文,陈宝安,高峰,丁家华,许文林1,沈惠玲1,高冲,孙耘玉,程坚,王骏,赵刚,马燕 作者单位：东南大学临床医学院, 东南大学中大医院血液科,南京 210009;1江苏大学附属人民医院血液科，镇江 212002;基金项目：本课题受国家自然科学基金资助(39970832);省科技发展计划(社会发展)BS20020224

　　【摘要】 本研究探讨环孢菌素A(CsA)、雌激素受体抑制剂雷洛昔芬及其联合应用对K562/A02细胞多药耐药的逆转作用。采用甲基四唑蓝法(MTT)测定柔红霉素(DNR)的半数抑制量，RT-PCR法检测mdr1基因mRNA表达水平，FCM检测P-gp的表达和细胞内DNR浓度。结果表明： DNR对K562/A02和K562细胞的IC50分别为23.51和0.29mg/L，雷洛昔芬(2.5 mg/L)及CsA( 1 mg/L)单用和两药联合处理K562/A02细胞时， DNR的IC50值分别为5.98、8.15和3.68 mg/L，两药对DNR作用K562细胞的IC50没有影响。CsA及雷洛昔芬单独作用后耐药株mdr1 mRNA下调微弱，联合用药下调效果明显。CsA及雷洛昔芬均可降低P-gp蛋白的表达，且具有协同作用。同时还观察到逆转剂雷洛昔芬和CsA作用后细胞内柔红霉素浓度增加，两药联合作用时效果增强。结论： CsA及雷洛昔芬均可逆转耐药,且联合作用效果增强。

　　【关键词】 环孢菌素A,雌激素受体抑制剂,雷洛昔芬; K562/A02细胞; 多药耐药

　　AbstractThis study was aimed to investigate the reversible effect of cyclosporine A, raloxifene and their combination on multidrug resistance cell line K562/A02. The IC50 (the concentration causing 50% inhibition of cell growth) of DNR were assayed by MTT method, the expression level of mdr-1 mRNA was assayed by RT-PCR, p-glycoprotein (P-gp) expression and intracellular DNR concentration were detected by flow cytometry. The results showed that the IC50 of DNR on K562/A02 and K562 cells were 23.51 mg/L and 0.29 mg/L, respectively. The IC50 of DNR on K562/A02 cells in treatment with raloxifene CsA and both combination were 5.98,8.15 and 3.68 mg/L respectively, but both drugs not influenced IC50 of DNR on K562 cells. Pretreating K562/A02 cells with raloxifene (2.5 mg/L) or CsA (1 mg/L) for 48 hours partially restored the sensitivity of K562/A02 cells to DNR. Cyclosporine A and raloxifene (alone or combination) elevated the intracellular DNR concentration in K562/A02, down regulated P-gp and mdr-1 mRNA expressions. It is concluded that multidrug resistance (MDR) can be partially reversed by CsA or raloxifene, the combination of both drugs shows a great synergistic reversal effect.

　　Key wordscyclosporine A; estrogen-receptor inhibitor; raloxifene; K562/A02; drug resistance

　　多药耐药(multidrug resistance, MDR)系多因素所致,肿瘤细胞mdr1基因过度表达导致细胞膜上相对分子质量170×103的糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)增多是产生MDR的主要机制,P-gp具有药物"泵"的功能,能将进入肿瘤细胞内的化疗药物主动地泵出细胞外以减少细胞内药物蓄积,从而使肿瘤细胞发生MDR [1]。肿瘤化疗失败的主要原因之一是多药耐药性的产生，因此如何成功地逆转多药耐药是当前肿瘤治疗学中的一个研究热点。已有文献报道，屈洛昔芬不能明显增强化疗药物柔红霉素(DNR)对K562敏感细胞的杀伤作用,但能明显增强DNR对K562/A02耐药细胞的杀伤作用[2]。国外有文献报道,单独应用环孢菌素A(CsA)或雷洛昔芬在体外实验中获得了一定的逆转效果,我们以白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为实验研究对象进行体外实验。

　　材料和方法

　　细胞系和培养条件

　　K562/A02细胞是经阿霉素逐步诱导、具有MDR表型的稳定细胞系,由中国医学科学院血液学研究所提供,实验前无药培养2周。K562敏感株由中国科学院上海细胞生物研究所提供。细胞培养液由RPMI 1640培养液(Gibco BRL)、10%小牛血清和青霉素、链霉素各100 U/ml组成。K562细胞置于37℃、5% CO2培养箱中,2-3天传代1次。

　　药物及试剂

　　柔红霉素(DNR)为意大利Farmitalia公司产品，环孢菌素A(CsA)为瑞士山德士公司产品，雷洛昔芬(由江苏省药物所提供)，四甲基偶氮唑盐(MTT)为Fluka公司产品,用PBS配制成5 g/L。 PCR引物mdr1(436 bp)(上海生工生物工程技术服务有限公司提供)F: 5′-TGGTTTGATGTGCACGATGTTGGG-3′, R: 5′-AGATCAGCAGGAAAGCAGCACCTA -3′; β-action(内参照)(270 bp) F: 5′-CTACAATGAGC TGCGTGTGGC -3′, R:5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC -3′。

　　逆转剂对DNR细胞毒性影响的MTT法测定

　　取对数生长期细胞, 加入逆转剂(单用或联合，CsA终浓度1 mg/L,雷洛昔芬终浓度2.5 mg/L)作用1小时,按所设梯度加入不同浓度DNR,每个浓度设3个复孔。另设不加逆转剂、不加DNR、不加细胞的对照组，接种于96孔板,每孔含2×105个细胞悬液200 μl。置于37℃、5% CO2培养箱孵育48小时后取出,加MTT反应液20 μl，继续培养4小时后,于平板离心机上2 500×g离心10分钟,弃上清,每孔加150 μl二甲亚砜溶解,微量振荡器混匀,酶标仪上测定540 nm波长的吸光度(A)。计算细胞的生长抑制率：生长抑制率(%)=(1-试验孔A/对照孔A)×100%根据生长抑制率采用综合法计算半数抑制量(IC50)。逆转倍数=耐药株IC50/加逆转剂后IC50实验重复5次,每次设3个复孔,取平均值为最终结果。

　　mdr1基因mRNA表达水平的RT-PCR测定

　　取K562/A02细胞(终浓度2×105/ml,每组4 ml),分组加药;分别于37℃、5% CO2培养箱中,孵育48小时收集细胞。细胞内总RNA的提取:取干预好的各实验组细胞,离心弃上清后,直接于离心管中加入1 ml TRIZOL试剂 (Molecular Reseach Center公司产品)提取总RNA。 RT-PCR: cDNA合成所需逆转录酶及体系均为TaKaRa LA PCR TM Kit Ver.2.1试剂盒(大连宝生物工程有限公司产品)，PCR仪为Gene Amp PCR System 2400(Applied Biosystems)。按试剂盒说明书进行操作,细胞总RNA反应量均为2 μg，总反应体积为25 μl。

　　反应条件为①逆转录反应: 30℃ 10分钟,42℃ 30分钟,99℃ 5分钟,5℃ 5分钟; ②PCR反应: 94℃ 2分钟,预变性; 94℃ 30秒,56℃ 30秒,72℃ 4分钟,30个循环。PCR产物于4℃下短期保存。

　　PCR产物的检测和分析选取5 μl PCR产物，取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳50分钟,溴化乙锭染色，紫外灯下照相,用ImageMaster VDS图像分析处理系统扫描。图像输入计算机,用ImageMaster Total Lab分析软件进行灰度分析,并以β-action校正作相对量分析,数值以两者之积分吸光度的比值表示。

　　P-gp表达的FCM检测

　　取K562/A02细胞株,终浓度2×105/ml，分组加药，分别孵育48小时、收集细胞。冷PBS液洗3次, 2 500×g离心5分钟,弃上清,加入P-gp单克隆抗体5 μl(标有荧光素PE)。避光,常温保存20分钟后,加生理盐水洗1次, 2 500×g离心5分钟,弃上清,加0.5 ml生理盐水,上流式细胞仪(FACS Calibur 美国Becton Dickinson公司产品)检测。

　　细胞内DNR浓度测定

　　取K562/A02细胞株，终浓度2×105/ml，分组加药，分别孵育48小时，另设K562细胞及不加逆转剂K562/A02细胞对照组(细胞终浓度2×105/ml)，分别加入DNR(浓度： 1 mg/L)，置于37℃、5% CO2培养箱孵育2小时，冷PBS液洗3次, 2 500×g离心5分钟,弃上清用流式细胞仪测定细胞内DNR浓度。

　　统计学处理

　　分组实验比较采用t检验。用SPSS 11.0统计软件进行分析。

　　结果

　　逆转剂处理前后DNR对K562细胞和K562/A02细胞的毒性作用

　　DNR对K562/A02细胞和K562细胞的IC50分别为2351 mg/L和0.29 mg/L,耐药倍数为81。用雷洛昔芬(2.5 mg/L)处理后, DNR对K562/A02细胞的IC50为 5.98 mg/L，逆转倍数为 3.93。CsA( 1 mg/L)处理K562/A02细胞后DNR IC50为8.15 mg/L，逆转倍数为288。两药联合对DNR作用K562/A02细胞的IC50值为3.68 mg/L，逆转倍数为6.39。逆转剂对K562/A02细胞的DNR毒性有明显影响(P<0.01)(表1)。雷洛昔芬(2.5 mg/L)处理后DNR对K562细胞的IC50值为0.32 mg/L。CsA(1 mg/L)处理后DNR对K562细胞的IC50为0.31 mg/L。两药联合对DNR作用K562细胞的IC50值为028 mg/L。逆转剂对DNR作用K562细胞的DNR毒性无明显影响(P>0.10)(表2)。Table 1. Inhibition rate of DNR on proliferation of K562/A02 cells treated with DNR, CsA and raloxifene for 48 hours (略)

　　逆转剂对耐药基因mRNA表达的调节作用

　　K562细胞mdr1 mRNA表达为阴性,K562/A02细胞mdr1 mRNA表达为阳性。 K562/A02细胞空白对照组及K562/A02细胞经DNR(1 mg/L)作用48小时，K562/A02细胞经CsA(1 mg/L)和雷洛昔芬(25 mg/L)单用或联合作用48小时后，mdr1与β-action的比值分别为1.313,1293,1.232,1.052,0449(表3)。Table 2. Inhibition rate of DNR on proliferation of K562 cells treated with DNR, CsA and raloxifene for 48 hours (略)Table 3.　 mdr1 mRNA expression of K562/A02 cells treated with DNR,CsA and raloxifene for 48 hours by RT-PCR analysis(略)

　　P-gp蛋白的FCM检测

　　K562敏感株、K562/A02耐药株P-gp荧光强度分别为 3.58及104.96。K562/A02细胞经CsA(1 mg/L), 雷洛昔芬(2.5 mg/L)及 CsA(1 mg/L) +雷洛昔芬(2.5 mg/L)联合作用48小时,P-gp荧光强度分别为 78.29, 85.02和 57.89。

　　细胞内DNR浓度测定

　　未加逆转剂的K562/A02耐药株细胞内DNR浓度为K562敏感株的12%。K562/A02经CsA(1 mg/L), 雷洛昔芬(2.5 mg/L)及 CsA(1 mg/L) +雷洛昔芬(2.5 mg/L)联合作用48小时, 细胞内DNR浓度分别为K562敏感株的33%、12.78%和45.29%。CsA处理组及CsA联合雷洛昔芬处理组，细胞内DNR浓度明显增加，与K562/A02对照组间有显著性差异(P<0.05)(图2) 。

　　讨论

　　目前的研究表明，MDR的产生是多种基因产物共同作用的结果，参与多药耐药发生的因素主要有以下几方面[3]： ①肿瘤细胞表面ATP结合膜糖蛋白的表达增加或活性提高，包括P-gp、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺抗药性相关蛋白(LRP) 、乳腺癌抗药性相关蛋白(BRCP)等几类;②谷胱甘肽S转移酶(glutathione S transferase)的表达增加或活性增强;③TOPOⅡ含量减少及活性降低;④蛋白激酶C(protein kinase C, PKC) 的表达增加或活性增强;⑤肿瘤细胞抗凋亡能力增强。耐药逆转剂的研究也是从以上几个方面来进行。杨纯正教授等[4]认为,目前能在临床证实跟一些肿瘤耐药相关的基因只有mdr1/P-gp。所以P-gp仍是临床克服多药耐药主要的靶点和观察指标。临床用来克服耐药的手段主要有两个：①尽量选择患者敏感的药物，加大化疗药物剂量;②应用多药耐药逆转剂联合化疗以克服耐药。在上述二类药物中前者是应用比较普遍的方法，但疗效不理想，患者往往因出现各种严重的并发症而死亡。在目前，联合使用逆转剂已成为耐药逆转研究的发展趋势。合理使用不同作用机制、毒副反应无叠加的两种或多种耐药逆转剂不但可起到协同增敏作用,而且可降低单一逆转药物剂量,减少副作用,提高耐受性[5]。 CsA是最早用于耐药逆转研究的、且为体外实验效果最好的经典药物之一。它主要通过与化疗药物竞争和P糖蛋白结合,从而使细胞内药物浓度增加而逆转耐药[6]。研究表明CsA是广谱MDR相关蛋白的调节因子，除了与P-gp结合还能影响MRP 、BRCP活性[7]。它有明显的剂量效应,当达到10 μmol/L时逆转作用最强,但其毒副作用也随之增大,所以在临床应用有一定的局限性。本课题组曾采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westen blot方法检测汉防己甲素(1 μmol/L)联合屈洛昔芬(5 μmol/L)应用于K562细胞的作用，48小时后K562细胞bcr/abl mRNA表达开始下调,K562细胞P210 BCR/ABL蛋白表达于72小时开始下调。这一结果说明两药联合应用可下调K562细胞bcr/abl的表达,这可能是两药联用逆转耐药的机制之一[8]。雷洛昔芬是新一代非选择性雌激素受体拮抗剂，也是一种蛋白激酶C(PKC)抑制剂,与屈洛昔芬有类似作用，比屈洛昔芬副作用小，主要用于预防骨质疏松和治疗乳腺癌，它既无异搏定的严重心血管毒性反应,也无环孢菌素A的肾脏毒性及过敏反应[9，10]。剪切因子SPF45(RBM17)在许多实体瘤上高表达，诱导肿瘤细胞对阿霉素及长春新碱耐药，雷洛昔芬可以逆转SPF45诱导耐药的作用[11]。最新的研究表明，雷洛昔芬的吸收渗透性(PAB)低于分泌渗透性(PBA)，但在CsA及维拉帕米作用下雷洛昔芬PAB升高[12]。国外已有人开始研究雷洛昔芬与多药耐药的关系，国内尚无相关报道。基于上述考虑,本实验联合环孢菌素A和新药雷洛昔芬逆转临床发生的多药耐药。作为逆转剂,应具有逆转作用而本身又无细胞毒作用。我们通过MTT预实验，CsA在(5 mg/L)及以下浓度，雷洛昔芬在(10 mg/L)及以下浓度，对K562细胞系及K562/A02细胞系均无直接细胞毒性,我们选用CsA(1 mg/L)和雷洛昔芬(2.5 mg/L)时发现，两药不能增强化疗药物DNR对K562细胞系的杀伤作用，但能明显增强DNR对K562/A02细胞系的杀伤作用。本实验用RT-PCR的方法检测了mdr1 mRNA的表达水平，结果显示K562细胞系无mdr1 mRNA表达,而K562/A02细胞系mdr1 mRNA高表达, CsA及雷洛昔芬单独作用后耐药株mdr1 mRNA表达下调微弱，联合用药下调效果明显。P-gp具有药物"泵"的的功能,能将进入肿瘤细胞内的化疗药物主动地泵出细胞外以减少细胞内药物蓄积,从而使肿瘤细胞发生MDR 。P-gp蛋白的荧光强度与细胞膜上蛋白的表达量成正比。本实验显示，CsA及雷洛昔芬处理过的耐药株P-gp蛋白的荧光强度下调，两药联合下调更明显，这表明CsA及雷洛昔芬均可降低P-gp蛋白的表达，且具有协同作用。同时我们还观察到逆转剂作用后的细胞内柔红霉素浓度增加，联合作用效果增强。本研究显示, CsA及雷洛昔芬可以增加细胞内DNR的浓度，并在转录及蛋白表达两个水平上阻断耐药基因,且联合作用效果增强,具有协同作用,为临床联合应用耐药逆转剂提供了理论依据。总之,药物的联合应用逆转白血病细胞多药耐药,既可减少药物的毒副作用,又增强了逆转效果,它具有广阔的临床应用前景。

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