骨髓增生性疾病止血功能的研究

　　作者：朱筱,裴敏飞,徐敏1,张广森 作者单位：长沙市第四医院肿瘤血液科， 长沙 410006;1中南大学湘雅第二医院血液科， 长沙 410011

　　【摘要】 本研究通过测定骨髓增生性疾病(myeloproliferative disease,MPD)患者血小板聚集功能、血浆血管性血友病因子相关抗原(vWF:Ag)及血管性血友病瑞斯托霉素辅因子(vWF:Rco)活性，观察MPD患者初期止血功能的变化，并与临床资料结合探讨实验室检测结果异常的意义。共观察MPD患者35例，正常对照20例。以瑞斯托霉素(ris)、二磷酸腺苷(ADP)、胶原(col)及肾上腺素(adr)作为血小板诱聚剂测定血小板聚集功能;采用酶联免疫吸附双抗体夹心法测定血浆vWF:Ag水平;测定瑞斯托霉素诱聚(RIPA)明显降低的6例患者血浆vWF:Rco活性。结果显示：35例患者血小板聚集功能与正常比较明显降低，4种诱聚剂诱导血小板最大聚集率与正常对照组比较均明显降低(P<0.001或P=0.002)。血小板聚集功能异常的患者高达71.4%(25/35);MPD患者血浆vWF:Ag水平较正常对照无明显差别(105.11±47.54% 与 111.88±55.24%,P>0.50); RIPA明显降低的6例MPD患者血浆vWF:Rco活性测定示1例原发性血小板增多症(essential thrombocytosis,ET)患者明显低于正常水平，其余患者均在正常范围内;患者血小板计数与血浆vWF:Ag之间无相关性(r=-0.180)。患者血小板计数与4种诱聚剂诱导下血小板最大聚集率之间均无明显相关性。结论：MPD患者血小板聚集功能不良发生率高;1例ET患者有RIPA降低和vWF:Rco降低，但其血浆中是否存在vWF多聚物的缺乏，仍需进一步研究证实;研究观察期间未发现止血功能的异常与临床症状的相关性，但MPD患者中血小板功能缺陷的高发生率提示临床使用血小板抑制剂应持谨慎态度。

　　【关键词】 骨髓增生性疾病,血小板聚集功能,止血功能;von Willebrand因子

　　AbstractThis study was purposed to investigate the change of early hemostatic funetion in patients with myeloproliferative diseases (MPD) and to explore its significance in combination with clinical data. The platelet aggregative function was measured by using ristomycin,adenosine diphosphate, collagen and adrenine as inductors, the plasma von Willebrand factor-associated antigen (vWF:Ag) level was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), the plasma von Wellebrand factor-ristomycin cofactor (vWF:Rco) activity was measured in 6 patients with obviously low ristomycin induced platelet aggregation (RIPA). The results showed that the platelet aggregative function obviously decreased in 35 patients, there were distinct differences in maximal platelet aggregative rate between patients and normal controls induced by 4 inductors respectively (P<0.001,P<0.001,P=0.002,P<0.001). There was no obvious difference between patients with MPD and healthy controls in plasma vWF:Ag level (P>0.50). Plasma vWF:Rco activity in all 6 patients with MPD chosen was in the normal range,except one patient with essential thrombocytosis (ET) whose plasma vWF:Rco activity was much lower than normal. No correlation was found between platelet count and plasma vWF:Ag level in the patients (r=-0.180). No correlation was found between platelet count and maximal platelet aggregative rate induced by 4 inductors respectively in patients. It is concluded that the occurrence of abnormal platelet aggregative function is high in patients with MPD.The RIPA and vWF:Rco activity decrease in one patient with ET.However,the shortage of vWF polymer existed in his plasma have needs for further research. No correlation was observed between hemostsis and clinical manifestations.However,because of the high occurrence of platelet dysfunction in MPD patients,the clinical application of anti-platelet drugs should be considerated carefully.

　　Key wordsmyeloproliferative disease; platelet aggregative function; hematostatic function; von Willebrand factor

　　骨髓增生性疾病(myeloproliferative disesase,MPD)是一组因造血干细胞恶性克隆性增生所致的病变,包括慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)、真性红细胞增多症(polycythemia vera, PV)、原发性血小板增多症(essential thrombosis,ET)及特发性骨髓纤维化(idiopathic myelofibrosis,IMF)。出血与血栓形成是MPD患者临床常见的并发症。MPD患者一方面血小板增高甚为常见，而另一方面血小板质的异常也普遍存在。Cortelazzo等[1]研究发现，71%MPD患者(37/52)有血小板聚集的异常。血小板的功能异常有其结构和代谢基础，一定程度上反映了异常造血克隆的存在。MPD中vWF量和(或)质的缺陷也时有发生，有些可造成临床意料之外的出血。本研究通过检测35例MPD患者血小板聚集功能和血浆血管性血友病因子相关抗原(vWF:Ag)水平及部分患者血管性血友病瑞斯托霉素辅因子(vWF:Rco)活性,探讨该类患者初期止血的细胞和分子异常，并结合患者的临床特征，探讨检测变化与临床的关系。

　　材料和方法

　　研究对象

　　2004年3月至2005 年1月在我院血液内科住院的骨髓增生性疾病患者共35例，(所有患者均符合诊断标准[2])，其中CML 28例，PV 3例，ET 3例，IMF 1例。35例中男性22例，女性13例，平均年龄40.34岁(14-75岁)。20例健康志愿者为对照组，其中男女各10例，平均年龄为38.30岁(24-72岁)。全部受试者在采血检测前2周内均未服用阿斯匹林等影响血小板功能的药物，亦未接受骨髓抑制剂治疗，且家族中均无遗传性出血病史可询。

　　主要仪器及试剂

　　490-4D型血小板聚集仪为美国Chrono-log公司产品, MK2型酶标仪为美国Dragon公司产品,vWF:Rco活性检测试剂盒购自美国Chrono-log公司,vWF:Ag测定试剂盒(ELISA法)购自上海太阳生物技术公司,血小板聚集诱导剂瑞斯托霉素(Ris)、二磷酸腺苷(ADP)、胶原(Col)购自美国太平洋公司，肾上腺素(Adr)为金耀氨基酸公司产品。

　　实验方法

　　标本采集各组研究对象于空腹抽取肘静脉血9 ml，置于3.2%枸橼酸钠(1∶9)抗凝试管中，颠倒试管3次，使血液和抗凝剂充分混匀，常温下500 rpm离心5分钟，获富血小板血浆(PRP)。取2 ml用做血小板聚集试验，剩余PRP再以3000 rpm离心15分钟，以获取少血小板血浆(PPP)。取0.5 ml PPP用做血小板聚集功能测定调零，留取0.2 ml PPP于试管加盖置-70℃冰冻待检vWF:Ag和vWF:Rco。

　　血小板聚集试验(PAgT)按全国血小板功能检测标化会议所定标准进行[3]。以Ris、ADP、Col、Adr作为血小板聚集诱导剂，各诱导剂浓度分别为1.5 mg/ml、10 μmol/L、2 μg/ml和10 μmol/L。在Chrono-log 490-4D型四通道血小板聚集仪上诱导聚集，记录5分钟内血小板聚集曲线，血小板最大聚集率。

　　vWF:Ag含量测定采用酶联免疫吸附双抗体夹心法，按vWF试剂盒说明书操作。

　　瑞斯托霉素辅因子活性测定以定量瑞斯托霉素作诱导剂，其对定量的标准血小板悬液中血小板诱聚的强度与加入血浆中vWF因子活性相关，按试剂盒说明书操作步骤在490-4D血小板聚集仪上测定。

　　统计方法

　　数据采用样本均数±标准差(X±SD)表示，采用SPSS 11.5软件包进行两样本t检验和直线相关性检验。

　　结果

　　35例患者临床基本资料

　　见表1。此外该组患者在研究观察期间未发现栓塞现象，仅1例CML患者有出血表现。Table 1. Basic clinical data of 35 patients with MPD (略)

　　实验组及对照组PAgT检测

　　结果见表2。实验组血小板聚集功能较之正常对照明显下降。Table 2. PAgT results of 35 patients(略)

　　不同诱导剂作用下血小板聚集变化

　　以对照组血小板最大聚集率(Amax)的95%可信区间为血小板聚集率正常范围，据此分析实验组不同诱导剂血小板聚集异常发生情况。结果见表3。 Table 3. Abnormal PAgT induced by different inductors in test group(略)

　　实验组PAgT异常率分析

　　35例患者中有25例在诱导剂作用下PAgT异常，总异常率为71.4%(25/35)，这25例对单单一诱导剂、2种、3种或全部4种诱导剂的诱聚异常率分别为24%(6/25)，16%(4/25)，12%(3/25)，48%(12/25)，。

　　实验组vWF:Ag含量分析

　　实验组vWF:Ag为(105.11±47.54)%，与对照组(111.88±55.24%)比较，差别无显著性意义(P>0.50)。

　　6例RIPA明显降低患者的血浆vWF:Rco活性分析

　　结果见表4。正常vWF:Rco活性>40%。除患者4外其余均居于正常范围内。Table 4. Plasma vWF:Rco activity in 8 patients(略)

　　患者血小板数与血浆vWF:Ag含量相关分析示两者不存在直线相关关系(r=-0.180)。

　　患者血小板数分别与Ris、ADP、Col、Adr诱导的血小板最大聚集率相关回归分析

　　结果显示均不存在直线相关关系，r分别为0.249,0.166,-0.008,-0.030)。

　　讨论

　　骨髓增生性疾病为造血干细胞克隆增生性病变。出血和血栓形成是这类病变中矛盾的临床表现，已有一些研究力图揭示这类患者止血功能的异常，如血管、血小板及凝血与抗凝血改变[4,5]。本研究检测了初期止血的主要环节：血小板聚集功能、vWF水平，发现在MPD患者中，在生理性诱导剂(ADP、Adr、Col)及非生理性诱导剂(Ris)作用下血小板的聚集反应缺陷发生率高，占71.4%，主要表现为血小板聚集率的降低，4种诱聚剂中以Adr引起的诱聚异常最为常见，占57.14%。此外，对4种诱导剂均示诱聚不良者高达48%。Cortelazzo等[1]研究发现，71% MPD患者(37/52)有血小板聚集的异常。有研究认为，MPD患者出现血小板聚集功能异常的原因主要是血小板膜表面受体数量和功能的异常[5,6]。Jensen等[5]研究50例MPD患者发现，患者血小板膜表面GPⅡb/ Ⅲ a、GPIb受体数量及活性均明显低于正常水平，而GPⅣ受体数量则高于正常对照。 MPD患者血小板异常的原因，一般认为是骨髓造血干细胞克隆性病变所致[7]，即患者异常巨核细胞克隆所产生的血小板多伴有功能缺陷;Schafer等[8]研究1例CML患者，其血小板肾上腺素能受体丢失，肾上腺素诱导血小板聚集缺乏，但在接受异基因骨髓移植后，血小板的这些异常得到纠正，可随着移植物的丢失，血小板缺陷再度出现。也有研究认为，血小板在循环过程中被某些病理因素活化(如异常的血液流变学、免疫复合物、白细胞蛋白酶等)致血小板耗竭(spend),而产生各种实验室检查的异常[9]。 本组患者RIPA异常(降低)占51.43%。Ris诱导血小板聚集需有血小板vWF受体，即GPIb与GPIb/Ⅸ的存在和vWF质与量的正常。vWF:Ag测定在本组患者与正常对照间无显著性差别。进一步测定6例RIPA明显降低患者的vWF:Rco活性，发现1例ET患者(病例4)vWF:Rco活性明显降低。从RIPA、vWF:Ag、vWF:Rco活性的改变分析表明，该例患者可能存在vWF高分子多聚体的异常，但其血浆中是否存在vWF多聚体的缺乏，仍需进一步研究证实。该患者既往无出血病史，亦无异常家族史可询。van-Genderen等[10]研究36例ET患者，发现血浆大分子vWF量降低，且其与血小板数成反比，vWF:Rco/vWF:Ag比值与血小板数成反比，并认为这一现象对临床运用抗血小板聚集功能药物有一定指导意义。因阿司匹林常被用于MPD尤其是伴有血小板增高患者的治疗，此时如果患者同时伴有vWF异常，则可能导致出血加重。本组患者中，血小板聚集异常发生率高，血小板增多也常见，这也提示我们在此类患者中实施抗血小板治疗时更应慎重，需更多的临床和实验室监测，以防止药物性出血并发症的发生。检验检测初期止血功能的异常与临床出血/栓塞并发症的关系，或对出血/栓塞发生预测的意义，一直是研究者探讨的课题。尽管有些病例实验室指标的异常与临床出血/栓塞有一定相关性[4,10]，如vWF质或量的严重异常与出血相关，GPⅣ即凝血酶敏感蛋白受体的表达增高与阳性栓塞病史相关，但多数研究显示，这些指标的异常，尤其是血小板功能的缺陷不能明确预示临床出血/栓塞并发症的发生。也有一些研究发现，有出血/栓塞表现的患者，实验室指标异常的比例高，此点提示临床医生，对有实验室止血指标明显异常者，要警惕出血/栓塞并发症的发生。

　　【参考文献】

　　1 Cortelazzo S, Barbui T, Bassan R, et al. Abnormal aggregation and increased size of platelets in myeloproliferative disorders. Thromb Haemost,1980; 43:127-130

　　2 张之南.血液病诊断及疗效标准.北京：科学出版社,1998： 141-421

　　3 血小板功能检测标化会议纪要.中华血液学杂志，1985;6:183-185

　　4 Rao AK. Molecular and biochemical basis for the platelet dysfunction in myeloproliferative disorders. Semin Hematol, 2004; 41:6-9

　　5 Jensen MK, de-Nully Brown P, Lund BV, et al. Increased platelet activation and abnormal membrane glycoprotein content and redistribution in myeloproliferative disorders. Br J Haematol, 2000; 111: 116-124

　　6 Facon T, Caron C, Courtin P, et al. Acquired type II von Willebrand's disease associated with adrenal cortical carcinoma. Br J Haematol, 1992; 80: 488–494

　　7 Failkow PJ, Faguet GB, Jacobson RJ, et al. Evidence that essential thrombocythemia is a clonal disorder with origin in a multipotent stem cell. Blood,1981; 58: 916-919

　　8 Schafer AI. Bleeding and thrombosis in the myeloproliferative disorders. Blood, 1984; 64: 1–12

　　9 Phadke K, Dean S, Pitney WR. Platelet dysfunction in myeloproliferative syndromes. Am J Hematol,1981;10: 57-64

　　10 van-Genderen PJ, Budde U, Michiels JJ, et al. The reduction of large von Willebrand factor multimers in plasma in essential thrombocythaemia is related to the platelet count. Br J Haematol, 1996; 93: 962-965.