Skp2在急性白血病中的表达及与预后的关系

　　作者：于广晴,刘晓燕　　作者单位：佳木斯大学附属第一医院血液科，黑龙江 佳木斯

　　【摘要】 目的：探讨Skp2(S期激酶相关蛋白2)在急性白血病中的表达并分析其与预后的关系。方法：采用免疫组织化学法检测Skp2在51例初治急性白血病患者及20例良性血液病患者(对照组)骨髓细胞中的表达，并分析急性白血病阳性表达与阴性表达完全缓解率的差别。结果：Skp2在急性白血病骨髓细胞中阳性结果的表达率明显高于对照组(P<0.01);Skp2阳性表达患者的完全缓解率显著低于阴性表达患者(P<0.05)。结论：Skp2的过度表达与急性白血病的发生发展密切相关，且阳性表达可能提示急性白血病的预后不良。

　　【关键词】 急性白血病,Skp2(S期激酶相关蛋白2),免疫组织化学

　　Skp2即S期激酶相关蛋白2，是新近发现的DNA复制所必须的人类F-BOX蛋白家族中的一员。1995年,Zhang等[1]首次分离了编码p19和p45的cDNA,体外重组实验发现p19和cyclinA-CDK2的结合需要p45;体内微量注射抗体或反义寡核苷酸干扰p45的功能,发现细胞不能进入S期。由于p45是以前从未报道的cyclinA-CDK2相关蛋白且又主要存在于恶变细胞的S期,所以被命名为S期激酶相关蛋白2,简称Skp2。Skp2作为一种新的癌基因,已经成为人们日益关注的焦点。国内外大量资料表明，Skp2有癌基因的潜能，在多数恶性肿瘤中呈高表达或普遍表达。因此，Skp2基因的研究对于肿瘤的诊断治疗及判断病人预后具有广泛的前景。另外，Skp2在细胞周期中呈周期依赖性表达，靶向治疗能在周期中相应阶段增加化疗放疗的敏感性，这些特点使得Skp2的靶向治疗成为可能。近年来国内外已有Skp2与急性白血病关系的相关报道，但国内的报道并不多见，而且其是否能作为白血病的独立预后指标还未见相关报道。 基于这些，本实验旨在研究Skp2在急性白血病的表达并分析其与预后的关系，以便为多靶点治疗白血病提供新的突破口。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　初发急性白血病患者共51例,男33例,女18例,年龄17～73岁,中位年龄35岁。上述患者根据FAB标准诊断分型,部分经免疫分型及细胞遗传学证实,其中ANLL31例, ALL 20例。接受治疗病例均接受标准诱导缓解方案(ANLL用DA方案,M3应用亚砷酸,ALL应用VDP或VDLP方案化疗)。第一个疗程结束2～3周(M3患者亚砷酸治疗30d后)以骨髓缓解率作为判断疗效标准。正常对照组20例，为营养不良性贫血、过敏性紫癜等良性血液病患者骨髓，年龄18～68岁，中位年龄39岁。全部标本均来自佳木斯大学附属第一医院血液内科2007—10～2008—04收治的患者。

　　1.2 主要试剂

　　Skp2多克隆抗体，即用型SABC免疫试剂盒及DAB显色剂，EDTA抗凝剂，PBS缓冲液，抗体稀释液，均购自北京中杉生物有限公司。

　　1.3 方法

　　严格按照SABC免疫组化法进行。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据均采用SPSS15.0统计软件包进行处理，计数资料采用卡方检验。

　　2 结果判定

　　光学显微镜下观察，细胞胞核或质着黄色到棕黄色颗粒判为阳性,在高倍镜下每片计数200个除红系以外的单个核细胞,计算阳性细胞数占同类计数细胞百分比(%)，<25%为阴性，>25%为阳性，>50%为强阳性。

　　3 结果

　　急性白血病组Skp2阳性表达率为66.7%,其中在ANLL中的阳性表达率为71.0%,ALL中的阳性表达率为60.0%,二者与对照组(20.0%)比较,差别有统计学意义(P<0.01),而ANLL与ALL之间阳性率虽然有差异，但无统计学意义(P>0.05)。

　　ANLL患者中阳性表达患者的完全(CR)缓解率为59.1%,阴性表达患者的完全(CR)缓解率88.9%,二者比较,差别有统计学意义(P<0.05)。ALL患者中,阳性表达患者的完全缓解率为41.7%,阴性表达患者完全缓解率为87.5%,二者比较,差别有统计学意义(P<0.05)。

　　Skp2在AL骨髓中的阳性表达如图1，Skp2在AL细胞中的表达结果见表1，Skp2的表达与AL化疗反应的关系见表2。

　　图1 阳性细胞 (免疫组化法 ×400 )(略)

　　表1 Skp2在AL细胞中的表达(略)

　　与对照组相比(χ2=7.413,P<0.01)差别有统计学意义。

　　表2 Skp2表达与AL化疗反应的关系(略)

　　4 讨论

　　Skp2定位于人染色体5pl3[2],所编码的蛋白质分子量约为45kD。Skp2晶体结构由F-box序列、“Linker”序列、蛋白—蛋白相互作用模块如亮氨酸重复序列结构域(LRR)依次连接构成,Skp2以细胞周期依赖的形式在G1晚期开始出现，S/G2期高表达,然后其mRNA和蛋白水平迅速下降。Skp2的表达受转录及转录后水平双重调节,且在不同类型的细胞中起主导作用的调节机制不同。近年来的研究表明,泛素依赖性蛋白水解途径在真核生物中普遍存在,且是真核生物中调控蛋白含量的一个重要的转录后机制。细胞内泛素-蛋白酶体途径通过对泛素化蛋白进行降解[3]在细胞周期发展、基因转录及信号转导等过程中发挥重要作用。Skp2属F-盒蛋白家族成员,在泛素化过程中负责对底物蛋白的识别而决定SCFSkp2复合物作用的特异性。因此，Skp2的主要功能是作为SCF复合体的底物识别亚基,特异性识别[4]磷酸化的底物并介导其泛素化降解,是细胞从G1期进入S期的必需因子，它参与细胞周期的调控,与恶性肿瘤的发生发展密切相关。

　　国内外大量资料表明，Skp2有癌基因的潜能，在多数恶性肿瘤中呈高表达或普遍表达。近年来国内外已有Skp2与急性白血病关系的相关报道，但国内的报道并不多见，而且其是否能作为白血病的独立预后指标还没有相关报道。本组实验采用免疫组化法检测了51例急性白血病患者和20例正常对照者骨髓细胞Skp2的表达,结果显示,急性白血病细胞Skp2的表达明显高于正常骨髓细胞(P<0.01),在ANLL与ALL中均高表达，二者阳性率虽然有差异，但无统计学意义(P>0.05)。此结果与文献报道一致。此外，Skp2表达阳性患者的完全缓解率低于阴性表达患者,预后亦较差。本实验结果提示,Skp2的阳性表达与急性白血病的发生发展密切相关，且其阳性表达可能是急性白血病细胞对药物不敏感的原因之一,可作为判断急性白血病患者预后的指标,以指导临床治疗,而且针对Skp2的靶基因治疗,也可选择性地提高白血病治疗的敏感性,为白血病的治疗开辟新的途径。但是Skp2是否可以作为一个预测急性白血病患者预后的独立指标还有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]Zhang H,Kabayashi R,Galakitionov K,et al.p19 Skp1 and p45 Skp2 are essential elem ents of the cyclin A-CDK2S phase ki-nase[J].Cell,1995,82(13):915925

　　[2]Yokoi S,Yasui K,Saito OF,et al.Anovertergetgene,Skp2,within the 5p13 amplication that is frequently detected in small cell lung cancers[J].Am J Pathol,2002,161(1):207216

　　[3]Carrano AC, Eytan E, Hershko A, et al.SKP2 is required for ubiquitin-mediated degradation of the CDK inhibitor p27[J].Nat Cell Boil,1999,1(4):193199

　　[4]Nakayama KI,Nakayama K.Regulation of the cell cycle by SCF-type ubiquitin ligases[J].Semin Cell Dev Biol,2005,16(3):323333