细胞因子诱导的自然杀伤细胞培养体系的评价

　　作者：王　娟1,2，桑圣刚3 ，郝新宝1　 作者单位：(1.海南医学院附属医院血液肿瘤内科，海南 海口　571100;2.贵阳中医学院，贵州 贵阳　550000;3.海南医学院检验系，海南 海口　571100)

　　【摘要】 目的：评价采用γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、抗CD3单抗3因子对外周血来源的CIK细胞培养的效果。方法：采集17例实体肿瘤患者的外周血，分离单个核细胞培养，于培养第1天加入重组人IFN-γ，第2天加入抗人CD3单抗、重组人IL-2，隔天半量换培养液并添加人重组IL-2以维持其浓度，培养21 d收获细胞。于培养第1、7、14、21天进行细胞计数，同时于培养第1、8、14、21天测定细胞免疫表型。结果：细胞因子共刺激2～3 d即出现细胞集落，14 d后CIK细胞总数达(6～17)×109/L，较培养前扩增47～150倍，细胞存活率大于95%;具有免疫表型CD3+、CD4+、CD8+和CD3+CD56+细胞的平均值分别从培养前的(65.1±1.9)%、(36.9±0.8)%、(28.5±3.1)%、(1.8±0.4)%增加到培养第21天的(89.6±2.1)%、(50.1±1.9)%、(57.2±2.5)%、(36.1±4.2)%。结论：按照上述方法培养的CIK细胞在体外扩增率高，方法可行，CIK细胞在体外培养到14～21 d，CD3+CD56+呈现高表达，此时期适宜应用于临床治疗，且患者自体外周血易获得、整个培养过程简便，值得临床应用推广。

　　【关键词】 细胞因子诱导的自然杀伤细胞;细胞培养;γ-干扰素;白介素-2;抗CD3单抗

　　[ABSTRACT] Objective： To evaluate culture effects of?倓 cytokine-induced natural killer cell by IFN-γ， IL-2， anti-CD3， monoclonal antibody factor 3. Methods： Mononuclear cells were separated from peripheral blood that were collected from 17 patients with tumor and cultured. IFN-γ was added on day 1; IL-2 and anti-CD3 were added on day 2. Then 0.5 day later， half the amount of medium was abandoned， but the concentration was maintained by adding IL-2. The cultured cells were harvested on day 21. Cell amount were counted on day 1， 7， 14 and 21， and immunophenotyping detected on day 1， 8， 14， and 21. Results： After 2-3 days of culture， cell colony appeared. After 14 days， total number of CIK cells was (6～17)×109/L， 47-150 times more than the original samples. More than 95% cells survived; average number of cells that showed immunophenotypes of CD3+， CD4+， CD8+， CD3+ CD56+ before and 21 days after the culture were (65.1 ± 1.9)%， (36.9 ± 0.8)%， (28.5 ± 3.1)%， (1.8 ± 0.4)% vs (89.6 ± 2.1)%， (50.1 ± 1.9)%， (57.2±2.5)%， (36.1.1 ± 4.2)%. Conclusions： By the above mentioned culture system， number of cytokine-induced natural killer can be increased quickly， and it shows high expression of CD3+， and CD56+ showed high expression. Since autologous peripheral blood of patients is easy to be collected and this method is worthy of clinical application.

　　[KEY WORDS] Cytokine-induced killer cells; Cell culture; γ-interferon; Interleukin -2; Anti-CD3 monoclonal antibody

　　生物治疗作为肿瘤第4大治疗手段在临床治疗领域中发挥着越来越重要的作用。自体细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induce killer cell，CIK)为已知杀伤活性较强的肿瘤生物治疗效应细胞，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子，如γ-干扰素(IFN-γ)、抗CD3McAb、IL-2、 IL-lα等，共同培养一段时间所获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，又称为NK细胞样T淋巴细胞，兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤的特点[1]。因此，CIK细胞治疗被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK细胞能在体外被诱导且可以大量增殖，与以往报道的一些抗肿瘤效应细胞相比，其具有杀瘤活性高、杀瘤谱更广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞毒性很小等优点，是目前恶性肿瘤细胞免疫治疗中最具前景的细胞之一。对于CIK细胞的培养，经典的方法为Schmidt-Wolf等[2]用密度梯度离心法常规分离健康成人外周血，制备单个核细胞悬液，加入IFN-γ、IL-2、抗CD3单抗、IL-lα等多种细胞因子共同诱导培养。本文尝试使用IFN-γ、IL-2、抗CD3单抗这3种细胞因子来对实体肿瘤患者外周血来源的CIK细胞进行培养，以探讨培养体系的建立及最佳适用于临床的培养时间。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验仪器和试剂

　　王娟等.细胞因子诱导的自然杀伤细胞培养体系的评价　百级超洁净工作台、低温离心机(德国 eppendorf)，CO2培养箱(日本三洋)，培养瓶和离心管(美国康宁公司)，Olympus光学倒置显微镜。

　　淋巴细胞分离液[相对密度(1.077±0.002)g/mL，Cedarlane公司]，胎牛血清(上海鼎杰生物科技有限公司),1640培养基(美国 invitrogen)，IFN-γ(美国GIBCO)，IL-2(北京四环生物制药有限公司)，抗CD3单抗(美国 invitrogen)，流式细胞荧光标记抗体(美国BD公司)。

　　1.2　细胞计数、培养及检测

　　采集我院血液肿瘤内科17例实体瘤患者的外周血30 mL，用肝素钠抗凝管保存。经淋巴细胞分离液梯度离心(2 000 r/min×20 min)，取白色界面层单个核细胞，注射用生理盐水洗涤1次后离心(2 000 r/min×8 min)。计数每例患者的外周血单个核细胞总数为(0.7～1.4)×109/L，其中CD3+CD56+细胞约为(1～2)×108/L，置于含8%～10%胎牛血清的1640培养基中，细胞浓度调整为2×106个/mL，第1天培养加入IFN-γ 1 000 U/ml后，置于37 ℃、5%CO2环境中培养，24 h后加入抗CD3单抗100 ng/mL，重组人IL-2(rhIL-2) 1 000 U/mL，隔天半量换液补加IL-2，细胞浓度同前。根据卫生部2003年颁布的“人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则”[3]，细胞培养到第8、13天，取部分细胞进行细菌、衣原体、支原体、内毒素的检测均为阴性。于培养第1、14、21天进行台盼蓝染色法计算细胞存活率，同时于显微镜下计算细胞数目。在细胞培养第1、8、14、21天用流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+、CD3+CD56+。取13 mL细胞浓度为2×106/L细胞悬液加入不同单抗孵育30 min后，用PBS洗涤2次，采用流式细胞仪检测。

　　2　结果

　　2.1　CIK细胞形态学观察

　　17例肿瘤患者的外周血单核细胞在培养过程中及培养结束收集细胞时，均使用Olympus光学倒置显微镜观察，各组均可在培养第2～3天开始明显形成细胞集落，与郭智等[4]研究的结果基本一致，随着培养时间的延长，细胞集落开始越来越密集，变大，集落的数量随之增多。

　　2.2　CIK细胞存活率及数量

　　整个培养过程中分别在培养第1、14、21天进行3次台盼蓝染色，结果提示细胞存活率超过95%，而细胞数培养第1天为(0.7～1.4)×109/L，培养第14天为(6～17)×109/L，培养第21天达到(5～16)×109/L，细胞绝对数较培养前扩增了平均100倍左右。

　　2.3　CIK细胞免疫表型

　　经上述培养体系培养的CIK细胞的免疫表型较培养之前明显增加，CD3+由培养前(65.1±1.9)%增加到(89.6±2.1)%，CD4+由(36.9±0.8)%增加到(50.1±1.9)%，CD8+由(28.5±3.1)%增加到(57.2±2.5)%，CD3+CD56+由(1.8±0.4)%增加到(36.1±4.2)%，其中CD3+CD56+的倍数扩增了约30倍，结合CIK细胞扩增总数，此类细胞的绝对数增加了约数百倍(表1)。参照理想的过继免疫治疗细胞条件[5] ，细胞存活率>70%，CD3+CD56+NKT>30%，CD3+CD8+T 细胞>30%，则可以收获细胞，用于临床治疗。表1　不同时间CIK细胞的免疫表型

　　3　讨论

　　免疫细胞过继疗法已经成为肿瘤患者放、化疗后辅助治疗的重要手段之一，而其中CIK细胞治疗作为首选在临床广泛开展，即通过体外培养扩增、活化抗肿瘤T细胞、再回输体内以杀伤肿瘤细胞，对促进患者免疫系统重建、消除残留病变、骨髓净化等都有良好的效果。已经有大量研究表明[6-8]，CIK细胞治疗在临床应用中是安全、有效的。CIK细胞是一类有多种细胞因子共同诱导的杀伤细胞，在正常外周血中比例很小，仅占1%～5%。同时大量的实验研究已证明，其体外培养扩增性良好， 且对自身组织则没有细胞毒作用。CIK细胞的体外扩增有多种细胞因子的协同作用，促使 T 细胞大量表达 IL-2 受体，使 T细胞活化，以大量扩增免疫活性细胞，同时提高其中 CD3+CD56+ 细胞的绝对和相对计数。CIK细胞的体外培养，大多根据经典的培养方法[2]采用密度梯度离心法分离健康成人外周血，制备单个核细胞悬液，将细胞浓度调整为1×106个/mL进行培养，培养第1天加入IFN-γ 1 000 U/mL,24 h后加入300 U/mL rhIL-2， 100 U/mL rh IL-1，抗CD3单克隆抗体50 ng/mL，以后每3 天更换新鲜培养液和rhIL-2，并调整细胞浓度至2×105个/mL。本研究采用的培养体系与其类似，但进行了一些改动，未加IL-1，且将IL-2的用量调整至1 000 U/mL，抗CD3单抗调整至100 U/mL，隔天半量换液同时补加IL-2至原来浓度，从培养开始至结束，细胞绝对数扩增了平均100倍左右。说明此种培养体系用于临床是可行的。CIK细胞具有异质性为几种细胞的混合群体，CD3+ CD56+细胞是CIK细胞中最主要的效应细胞，且细胞毒作用几乎都存在于此类细胞中[2]。因此， CD3+CD56+细胞数量的增加提示CIK细胞抗肿瘤能力增强，也是 CIK细胞进行体外扩增培养主要检测的细胞免疫表型。本研究发现，CIK细胞中的CD3+ CD56+细胞由培养前(1.8±0.4)%增加到培养结束收集细胞时的(36.1±4.2)%，已经达到足够用于临床治疗的数量，与文献报道基本一致[9,10]。同时也提示CIK细胞培养在14～21 d为CD3+ CD56+细胞高表达的平台期，在此期间CIK细胞具有较强的抗肿瘤能力， 可取得较好的临床疗效。

　　【参考文献】

　　1　Nagaraj S， Ziske C， Schmidt-Wolf IG.Human cytokine-induced killer cells have enhanced in vitro cytolytic activity via non-viral interleukin-2 gene transfer[J]. Genet Vaccines Ther,2004,2(1)：12.

　　2　Schmidt-Wolf IG， Lefterova P ， Mebta BA ，et al . Phenotypic characterization and identification of effect or cells involved intumor cell recognition of cytokine-induced killer cells[J]. Exp Hematol， 1993,21：1673-1679.

　　3　杨光，王彬，何志洁，等.自体CIK细胞治疗晚期恶性肿瘤的临床研究[J].南京医科大学学报(自然科学版),2009,29：31-33.

　　4　郭智，陈丰，谭晓华，等.细胞因子诱导的杀伤细胞体外培养技术的评价[J].神经损伤与功能重建，2009,4(2)：110-113.

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　　6　Jiang J，Xu N，Wu C，et al.Treatment of advanced gastric cancer by chemotherapy combine with autologous cytokine-induced killer cells [J].Anticancer Res,2006,26(38)：2237-2242.

　　7　周启明，吴沛宏，赵明，等.原发性肝癌经综合微创治疗后联合细胞因子诱导杀伤细胞灌注的近期疗效观察[J].癌症，2006,25(11)：1414-1418.

　　8　赵明，吴沛宏，曾益新，等.经肝动脉栓塞化疗序贯联合射频消融和细胞因子诱导的杀伤细胞治疗肝细胞癌的随机研究[J].中华医学杂志，2006,86(26)：1823-1828.

　　9　文庆莲，吴天革，吴敬波，等.CIK细胞治疗对化疗后患者晚期全身情况的影响[J].时珍国医国药，2007,18(8)：2008-2009.

　　10　吴昌平，蒋敬庭，邓海峰，等.CIK细胞体外培养的免疫表型[J].江苏医药，2005,31(9)：644-645.