低氧诱导胎肝间质细胞表达胰岛素样生长因子

　　作者：刘革修 张洹 何冬梅 谭广销 作者单位：暨南大学医学院血液病研究所，广东 广州 510632

　　【摘要】 目的 观察低氧培养对胎肝间质细胞表达胰岛素样生长因子1(IGF1)的情况。方法 取第5代生长至次融合状态的小鼠胎肝间质细胞用含95% N2和5% CO2混合气培养，半定量RTPCR和ELISA检测IGF1 mRNA转录与IGF1浓度。结果 低氧培养2 h IGF1 mRNA即显著增高，4 h后 IGF1与βactin两者RTPCR产物信号比从常氧培养的(759±263)%增加到(3412±817)%，IGF1蛋白也显著增高;低氧培养8 h IGF1蛋白从常氧培养的(1769±381)ng/mg总蛋白增加到(9453±1586)ng/mg总蛋白(P<001)。结论 低氧可诱导胎肝间质细胞表达IGF1，提示低氧在组织缺血损伤疾病中的潜在治疗价值。

　　【关键词】 低氧,胰岛素样生长因子,小鼠,基因表达;间质细胞

　　最近研究显示，移植造血间质细胞可以改善脑缺血损伤等的症状〔1，2〕，但有关其作用机制尚不清楚。缺血脑组织提取物在体外能刺激骨髓间质细胞多种神经组织细胞营养生长因子〔3〕，这提示其治疗效果可能与所移植细胞在病变区分泌多种神经组织细胞营养生长因子有关，同时说明造血间质细胞在缺血组织即低氧环境中具有特殊生物学活性。胎肝是胚胎发育中晚期的主要造血器官，具有骨髓间质细胞的许多生物学活性〔4，5〕，胰岛素样生长因子1(insulinlike growth factor1，IGF1)在脑缺血中具有抗损伤和促使细胞存活等作用。本研究拟观察低氧对胎肝间质细胞IGF1基因表达的影响，以了解造血间质细胞在缺血组织中的生物学活性及其治疗缺血损伤机制，为其在组织缺血损伤疾病中的治疗提供依据。

　　1 材料与方法

　　11 试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清购自美国Gibco BRL公司，95% N2和5% CO2混合气购自广州氮气厂。

　　12 胎肝间质细胞的培养及其低氧处理 清洁级C57BL/6孕鼠，于孕145 d断髓处死，无菌操作取出胎肝，4℃ Hank′s平衡盐溶液洗涤2次，剪成小块，加入4 ml含2% 胎牛血清的平衡盐溶液，滴管反复吹打使分散成细胞悬液。以1×106/ml密度接种，以DMEM/F12 + 10%胎牛血清培养液培养(含100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素和025 mg/L两性霉素B)。4 d后半量换液，7 d后将未黏附细胞洗去，留黏附细胞传代。次融合状态的第5代细胞进行低氧处理：首先将培养液真空去气泡(注意无菌操作)，以去除其中所溶解的氧，然后将细胞换液、转移至持续通以缺氧混合气体(95% N2 + 5% CO2)的培养箱、37℃培养。细胞经鉴定为间质细胞：梭形、具有干细胞标志(Sca1+、CD34+)和间质细胞标志(vimentin+、fibronectin+、laminin+)、不表达内皮细胞和造血细胞分化抗原(VEcadherin-、CD45-)。

　　13 总RNA的提取及半定量RTPCR检测 低氧处理2、4、8、16 h时采用Trizol提取总RNA，1%甲醛凝胶电泳鉴定RNA质量。RTPCR使用试剂盒进行，取2 μl RNA (2 μg)、1 μl随机引物、Rnasin 20 U，混合，65℃变性10 min，4℃冰浴3 min，然后依次加入下列试剂：5×Buffer 4 μl,10 mmol/L dNTP 1 μl，01 mol/L DTT 2 μl，Rnasin 20 U，MMLV 100 U，用去离子水补至总体积，37℃反应60 min，90℃加热5 min。PCR扩增反应总体积为50 μl：5 μl 10×Buffer，1 μl 10 mmol/L dNTP、3 μl cDNA、上下游引物(25 μmol/L)、βactin上下游引物(25 μmol/L)、Taq酶25 U。PCR条件：94℃ 40 s、60℃ 50 s、72℃ 40 s。循环30次后，72℃延伸5 min。IGF1：上游 5ACT TGA AGA TGT CCC GTT GT3，下游 5TCG GAG GGC TTG GAG AAT3，产物长度500 bp;βactin：上游 5GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA3，下游 5CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC3，产物长度548 bp。引物由上海生物工程公司合成，PCR产物在20%的琼脂糖凝胶上电泳，使用LKB凝胶成像仪分析信号强弱，独立重复3次RTPCR全过程。

　　14 ELISA测定 低氧处理2、4、8、16 h时收获细胞和上清进行ELISA 实验，以蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度(BioRad)。细胞用细胞裂解液(01 mo l/L PBS、1mmo l/L MgCl2、45 mmol/L B巯基乙醇、01%Triton100) 裂解，上清10 000 r/min 离心后直接检测。酶联试剂盒(DSL102800) 购于美国Diagnostic Systems Laborataries公司。用酶免测定仪(DG23022A型) 在450 nm 波长处测定样本IGFⅠ蛋白浓度，含量表示为ng/ mg总蛋白。

　　15 统计学分析 利用SPSS100软件包进行数据处理。结果以x±s表示;用t检验统计。

　　2 结果

　　21 低氧诱导小鼠胎肝间质细胞IGF1 mRNA的表达 总RNA经10g/L琼脂糖甲醛变性凝胶电泳显示呈现3条清晰的条带(28S、18S和5S)，28S:18S约为2:1，提示实验用RNA质量符合要求。常氧压下培养的胎肝间质细胞的IGF1 mRNA水平较低，PCR产物IGF1与βactin信号比为(759±263)%;低氧培养则可显著促进胎肝间质细胞IGF1基因的表达。低氧培养2 h细胞的IGF1与βactin信号比为(1583±449)%(P<001);4 h时IGF1 mRNA水平达到高峰，PCR产物IGF1与βactin信号比为(3412±817)%(P<001);8 h时仍然维持于高水平;16 h后 表达水平下降，PCR产物IGF1与βactin信号比为(1905±574)(图1)。

　　图1 Analysis of IGF1 mRNA expression in hypoxiatreated mouse fetal liver stromal cells by semiquantitativeRTPCRCon is RTPCR products from total RNA of untreated cells2h， 4h， 8h，and 16h show hypoxiatreated timeβactin is internal controlThe picture is a representative RTPCR from three individual experiments(略)

　　图2 Expression of IGF1 proteins expression in hypoxiatreated mouse fetal liver stromal cells by ELISACon is from untreated cells2h，4h，8h，and 16h show hypoxiatreated time(略)

　　22 低氧促进小鼠胎肝间质细胞IGF1蛋白表达 ELISA检测显示，在常氧压下培养的胎肝间质细胞中，IGF1蛋白水平较低〔(1769±381)ng/mg〕;低氧培养2 h时，IGF1蛋白与常氧培养的接近〔(2283±476)ng/ mg〕;4 h时显著增高〔(4359±791)ng/mg〕;8 h时达到高峰水平〔(9453±1586)ng/mg〕(P<001);16 h时IGF1水平下降〔(6169±1092)ng/mg〕。

　　3 讨论

　　IGF1 是一种受生长激素调节的碱性单链多肽，由70 个氨基酸组成，分子量为11 kD，45%结构与胰岛素相似，主要由肝脏产生，通过胰岛素样生长因子结合蛋白( IGFBP) 转运至组织，与其受体结合产生多种生理效应，对各种组织细胞的生长都有重要作用。肺、脑等也可产生IGF1，通过内分泌、自分泌/旁分泌机制起作用。其主要生物学效应有如下两类：①类似胰岛素的促进组织摄取匍萄糖，刺激糖原异生和糖酵解和促进蛋白质和脂肪合成，抑制蛋白质和脂肪分解，减少血液游离脂肪酸和氨基酸的浓度;②刺激RNA、DNA 的合成和细胞增殖，特别是在细胞循环周期G0G1 和G1Gs 阶段等有丝分裂有重大意义。IGF1受体属细胞膜受体酪氨酸激酶系统，与IGF1有高度亲和力。近来发现，IGF1不仅是大脑正常发育所必须的生长调节因子/神经营养因子，可促进多种神经细胞发育分化和增殖，对树突快速生长，突触形成和髓鞘生成具有重要作用;而且IGF1能够减轻多种病理因素对CNS造成的损伤，能促进神经细胞的再生，有助于神经细胞受损后功能恢复。IGF1具有抗脑缺血损伤作用，可降低缺血脑组织血管的阻力、改善血液供应，抑制神经元和胶质细胞凋亡，能有效防止谷氨酸脱羧酶活性的丧失、对抗兴奋性氨基酸毒性，防止细胞的钙超载、抑制神经元坏死〔6～9〕。

　　本实验结果显示，低氧处理可提高胎肝间质细胞表达IGF1水平，提示其在脑缺血缺氧损伤的治疗中具有神经元保护作用，提示以此活性细胞可能治疗组织缺血损伤如脑缺血等疾病。

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