急性髓系白血病患者体内solGM-Rα的表达研究

　　作者：肖溶,张日,王友良,朱子玲　　作者单位：南京医科大学附属常州第二医院血液肿瘤科，常州 213003;

　　【摘要】为了研究GM-CSF可溶性α受体solGM-Rα在急性髓系白血病患者体内的表达，探讨其与AML患者临床特征的相关性及临床意义，以酶联免疫吸附试验ELISA法检测66例初治AML患者血浆标本solGM-Rα的含量，并与AML患者MIC检测结果及临床资料相结合，进行综合分析。结果表明：AML患者血浆solGM-Rα浓度明显高于正常对照，在M3型最低 (3897.75±2651.43 pg/ml)，而在M5型最高(9990.92±6325.43 pg/ml)(P<0.05)。solGM-Rα增高者多见于MIC的M5型，后者常伴有外周血白细胞增多、骨髓粒系原始细胞增多及CD34、CD95和CD116抗原高表达等特性。结论：solGM-Rα升高可能提示预后不良，GM-CSF及其受体系统介导的靶向杀伤值得进一步研究。

　　【关键词】 急性髓系白血病

　　Abstract To evaluate soluble GM-CSF-Rα expression in patients with acute myeloid leukemia (AML) and its clinic significance，plasma concentration of solGM-Rα in de novo 66 patients with AML was detected by enzyme-linked immuno-sorbent assay，and the relationship between solGM-Rα levels and various clinical parameters was analyzed.The result showed that the levels of solGM-Rα in plasma of patients with AML were significantly higher than that in plasma of normal controls; the lowest level of solGM-Rα was found in plasma of patients with AML-M3 (3897.75±2651.43 pg/ml)，the highest level of solGM-Rα was observed in plasma of patients with AML-M5 (9990.92±6325.43 pg/ml).Patients with high level of solGM-Rα were generally accompanied with a distinct clinical picture，including higher counts of white blood cell and myeloid precursors，as well as higher expression of CD34，CD95 and CD116 antigen.It is concluded that the high level of solGM-Rα in plasma of patients may suggest AML poor prognosis and play a role in pathogenesis of leukemia，the GM-CSF and its receptor solGM-Rα needs further study.

　　Key words acute myeloid leukemia; GM-CSF; solGM-Rα

　　粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)可通过自分泌及旁分泌机制影响急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)细胞集落的形成，在高度异质性的AML各型发生发展中可能具有重要作用[1]。GM-CSF 的可溶性α受体(solGM-Rα)可作为诱导受体竞争结合GM-CSF而下调其信号传导，并能直接拮抗GM-CSF的功能。我们对AML患者体内solGM-Rα的表达进行了相关研究，试图探寻其作为GM-CSF的内源性调节因子在AML发病中的作用。

　　材料和方法

　　病例及临床情况

　　66例MIC确诊的初诊未治AML患者，男30例，女36例，平均年龄39岁(14-65岁)，入院时平均Hb为73 g/L(34-125 g/L)、Plt为43.8×109/L[(3-210)×109/L]、WBC为37.2×109/L[(0.8-397.4)×109/L，中位数为11.8×109/L]。按FAB分类，M1 10例，M2 19例，M3 11例，M4 10例，M5 12例和M6 4例。18例对照组血浆标本来自健康初次献血员。所有患者在治疗前均作MIC检测，并按照染色体核型结果对AML的预后进行分级，即分为低危、中危和高危3组。低危组包括： t(15;17)、inv(16)、t(16;16)、t(8;21)及伴-X或-Y或del(9q)等;高危组包括：-5 、5q-、inv(3)、t(9;22)及复杂异常等;中危组包括：正常核型、+21、+8 等其它核型[2]。患者经MIC确诊后予DA 、HA或MA标准化疗方案治疗，给予M3患者ATRA诱导分化治疗，并分别统计1疗程的CR率，疗效判断标准参照文献[3]。

　　标本采集及实验研究

　　取患者治疗前清晨空腹肘静脉血3 ml，用肝素抗凝，2 000×g，离心15分钟后吸取血浆，分装于1 ml Eppendorf管，放置-20℃冰箱保存备用。测定前所有标本均于室温下解冻。solGM-Rα测定按Soluble GM-CSFR /CD116 ELISA KIT说明书要求进行。样本及标准品均采用复孔;根据预实验结果及说明书要求，实验前将标本10倍稀释，以酶联免疫吸附试验(ELISA)法检得患者血浆标本中solGM-Rα的浓度为实测值×10。

　　统计学处理

　　应用SPSS 10.0统计软件，对每例AML患者的临床及实验数据进行综合分析，各值以均数±标准差表示。

　　结 果

　　AML及各亚型患者体内solGM-Rα水平的变化

　　AML组的血浆solGM-Rα(sCD116)水平尽管高于正常对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。solGM-Rα水平在M5型和M3型两型中比较有差异，solGM-Rα水平在M3型最低，为3897.75±2651.43 pg/ml;而M5型solGM-Rα水平最高，为9990.9±6325.43 pg/ml(P<0.05)，其它各型比较均无差异。详见表1。Table 1. Plasma solGM-Rα levels in AML patients(略)

　　可溶性GM-CSF受体α的表达

　　由表1可知，solGM-Rα血浆浓度在M3型最低，M5型最高，在该两型中表达有差异(P<0.05)，但在其他各型比较均无差异。18例正常对照者的solGM-Rα为5647.02±1595.43 pg/ml。以正常对照者solGM-Rα浓度的95%的可信区间值作为正常范围(4853.63-6440.41 pg/ml)，将66例AML患者分为3组：solGM-Rα在正常范围者为正常对照组，solGM-Rα>6440.41 pg/ml者为高表达组，solGM-Rα<4853.63 pg/ml者为低表达组。3组患者在AML-FAB亚型中的分布见附图。66例AML患者中仅有6例solGM-Rα水平在正常范围，33例患者血浆中solGM-Rα浓度低于正常，主要可见于M2型、M3型和M1型;另27例患者solGM-Rα血浆浓度高于正常，多发生于M5型、M2型和M4型;M1型和M6型患者血浆solGM-Rα浓度异常增高和降低，未见有正常范围的solGM-Rα表达。但该3组在FAB亚型中的分布无显著性差异。

　　可溶性GM-CSF受体α与AML相关临床资料的关系

　　上述3组两两比较进行t检验显示，高solGM-Rα表达组发病时患者WBC数、外周血及骨髓的原幼细胞数均较另两组高(P<0.05)。免疫表型各CD抗原中，正常组患者较另两组异常者CD34抗原表达率低(P<0.05);低表达组较高表达组多伴CD19表达(P <0.05);高表达组较低表达组CD14、CD116表达率高(P <0.05)，较正常组CD34(P<0.05)、CD95(P<0.01)、CD116(P<0.01)表达均高(表2)。但在AML患者性别、年龄、血红蛋白、血小板数等方面均无差异。Table 2.Expression of CD antigens in groups with various expression levels of solGM-Rα (略)

　　此外，表3显示solGM-Rα水平降低及升高的两组患者完全缓解率较solGM-Rα水平正常组低，这表明solGM-Rα异常表达可能提示患者预后较差，但因本研究中观察例数较少，统计学分析的3组患者缓解率、是否伴发感染及低中高危染色体核型的分布比较均无显著性差别(Pearson Chi-Square检验，P均>0.05)，所有这些有待进一步增加病例数继续深入研究。Table 3. solGM-Rα levels and AML various clinical parameters (略)

　　讨论

　　造血生长因子KL(c-kit配体)、FL(Flt3配体)、IL-3、GM-CSF、G-CSF等与AML基础和临床的相关研究一直是实验血液学的热点。最近研究显示，GM-CSF对AML细胞具有抑制凋亡和促进凋亡的双效作用，并影响凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-XL、survivin和XIAP以及周期蛋白 D2、caspase 3、procaspase 2和3等[4]。GM-CSF的生物学功能是通过表达于细胞膜上的特异性受体(GM-CSF receptor，GM-R)介导的。GM-R由α和β两个亚单位组成，GM-Rα亚单位为GM-CSF所特有，以锚定于细胞膜的跨膜分子形式(tmGM-Rα)存在，当被蛋白酶水解或mRNA选择性剪切后则形成可溶性分子形式(solGM-Rα)。对solGM-Rα蛋白与AML的关系，国外Sayani等[5]利用表达tmGM-Rα的HL-60、U937、THP1细胞系及不表达tmGM-Rα的K562细胞进行了研究，发现表达tmGM-Rα的造血细胞可产生solGM-Rα，用于骨髓移植的外周血干/祖细胞(PBSC)的血浆、新分离的中性粒细胞悬液中也含有solGM-Rα;并建立了精确的ELISA检测法，测得在正常人血浆中 solGM-Rα的浓度为36±17pmol，4/5例AML患者和1/4例多发性骨髓瘤患者血浆solGM-Rα的水平高于正常对照。我们测得AML患者血浆solGM-Rα水平尽管高于正常对照，但差异无统计学意义。我们的研究显示，solGM-Rα在AML-M3患者血浆中浓度最低，M5患者中最高，该两型比较有差异。血浆solGM-Rα高表达的AML患者伴有高WBC数和高原幼粒细胞数，同时还伴有CD34、CD95和CD116抗原的高表达。文献报道高WBC数、高原幼粒细胞数及CD34、CD95高表达多预后较差，提示AML患者过高表达solGM-Rα时常预示预后不良。Michael等[6]分析了257例血液肿瘤患者solGM-Rα蛋白的表达水平，观察到AML患者solGM-Rα蛋白水平高于ALL患者，solGM-Rα高表达(>85 pmol/l)的AML患者具有显著的临床特征，即FAB亚型多为AML-M4和M5亚型，且起病时外周血白细胞数和骨髓髓系原始细胞数增多;同时此类患者肺部感染的发生率相对较低，与我们的研究结果部分符合，我们推测solGM-Rα高者CD116抗原表达亦高，似与表达跨膜GM-Rα的造血细胞可产生solGM-Rα有关，至于CD34抗原高表达者solGM-Rα血浆浓度较高，可能因solGM-Rα血浆浓度升高，竞争性结合GM-CSF，使其浓度降低，从而拮抗GM-CSF功能，阻碍了髓系细胞的分化发育，使AML细胞呈现较原始的CD抗原表达，高浓度solGM-Rα可结合GM-CSF，使血浆GM-CSF浓度降低。因此solGM-Rα可能作为GM-CSF的内源性调节因子在AML的发病中发挥一定作用。

　　【参考文献】

　　1 Majka M，Janowska-Wieczorek A，Ratajczak J，et al. Numerous growth factors，cytokines，and chemokines are secreted by human CD34+ cells，myeloblasts，erythroblasts，and megakaryoblasts and regulate normal hematopoiesis in an autocrine/paracrine manner.Blood，2001; 97: 3075-3085

　　2 Byrd JC，Mrozek K，Dodge RK，et al. Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success，cumulative incidence of relapse，and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461).Blood，2002; 100: 4325-4336

　　3 张之南，沈悌主编.血液学诊断及疗效标准.第二版，北京：科学出版社，1998: 214-216

　　4 Faderl S，Harris D，Van Q，et al.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) induces antiapoptotic and proapoptotic signals in acute myeloid leukemia.Blood，2003; 102: 630-637

　　5 Sayani F，Montero-Julian FA，Ranchin V，et al. Identification of the soluble granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor protein in vivo. Blood，2000; 95: 461-469

　　6 Trus MR，Bordeleau L，Pihl C，et al. Clinical manifestations associated with the aberrant expression of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor in patients presenting with haematological malignancies.Br J Haematol，2003; 121: 86-93