急性髓系白血病细胞Flt-3表达及Flt-3/ITD突变分析

　　作者：汪亚伦,王彤,许凤,冮岩,王杰　　作者单位：沈阳医学院生化及分子生物学教研室，沈阳 110034

　　【摘要】本研究探讨急性白血病(acute leukemia，AL)细胞株Flt-3基因表达和Flt-3/ITD突变与急性白血病特别是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)发病的关系。采用RT-PCR分析联合测序的方法检测82例白血病细胞株，其中包括20例AML细胞株和57例急性淋巴细胞白血病细胞株(ALL)，5株CML细胞株的Flt-3表达和Flt-3/ITD突变。结果表明： 77例AL细胞株中有48例Flt-3表达阳性，阳性表达率为62%，其中20例AML细胞株中有12例阳性，阳性表达率为60%;57例ALL细胞株中有33例阳性，阳性表达率为58%。5例CML细胞株中有3例阳性，阳性表达率为60%。12例Flt-3表达阳性的AML中有1例AMOL细胞株存在有异常表达(阳性率为8.3%)，测序显示存在有29 bp的两个编码重复序列，其余Flt-3表达阳性的细胞株未检出重复序列。未分化B细胞系Flt-3基因表达阳性率明显高于成熟B细胞ALL (P<0.05)。结论: Flt-3基因在不同种类的白血病细胞中存在着不同程度的表达，在其中1例AML中发现有Flt-3/ITD重复序列。Flt-3基因及Flt-3/ITD突变检测可能有助于ALL特别是AML的诊断。

　　【关键词】 Flt-3 基因

　　Abstract This study was aimed to explore the relationship between Flt-3 expression，Flt-3/ITD mutation in acute leukemia (AL) cell line and pathogenesis of AL，especially AML. The Flt-3 expression and Flt-3/ITD mutation were detected by RT-PCR and sequencing method in 82 leukemia cell lines including 20 AML，57 ALL and 5 CML cell lines. The results indicated that positive results of Flt-3 expression were obtained in 48 out of 77 AL cell line，the positive rate was 62%; 12 cell lines were positive in 20 AML cell lines，the positive rate was 60%; 33 cell lines was positive in 57 ALL cell lines，the positive rate was 58%; 3 cell lines were positive in 5 CML cell lines，the positive rate was 60%. There was abnormal gene product in 1 AMOL cell line out of 12 AML cell lines with Flt-3 positive expression (positive rate 8.3%). DNA sequencing of abnormal gene product showed two coding duplication sequence with 29 bp long. The positive rate of Flt-3 expression in undifferentiated cell line was prominently higher than that in mature B cell ALL (P<0.05). It is concluded that the Flt-3 expression is different in various leukemia cells. Flt-3/ITD duplication was found in one AML cell line. The detection of Flt-3 gene and Flt-3/ITD mutation may contribute to the diagnosis of ALL，especially to AML.

　　Key words AML; Flt-3 gene; Flt-3/ITD mutation

　　近年来的研究表明，Fms样酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3，Flt-3)在正常的造血分化过程中具有重要的作用[1]。人Flt-3基因定位于染色体13q12，具有RTKm成员共同的结构，由胞外5个免疫球蛋白样结构区、近膜区(JM)、穿膜的2个激酶区(TK1和TK2)[由1个激酶插入区(KI)分隔]、C-端胞内区等几部分构成[2]。Flt-3除了在胸腺、肝、脾和淋巴结等组织中表达之外，而且也存在于人骨髓等造血系统，具有诱导造血干细胞分化和增殖的作用。Flt-3跨膜区内部串联重复(internal tandem duplication，ITD)突变是近年来发现的Flt-3 基因最常见的一种突变类型，与AML的发生有关，是AML中发生率最高且与预后相关的突变[3]。为探讨Flt-3特别是Flt-3/ITD突变在恶性血液病不同类型、亚型的突变及分布情况，我们运用聚合酶链反应结合测序的方法对不同种类的AL细胞株的Flt-3基因表达和Flt-3/ITD突变进行了研究，探讨Flt-3与AML发生的关系。

　　材料和方法

　　白血病细胞株

　　82个白血病细胞株包括AML细胞株20个(AML M1/M2 11个，AMMOL M4 1个，AMOL M5 8个)，ALL细胞株57个(c-ALL 21个，pre-B ALL 9个，B-ALL 11个，T-ALL 16个) 和CML细胞株5个。

　　细胞的采集

　　取用ACD-A抗凝骨髓5 ml，常规分离骨髓单个核细胞(BMMNC)，其中2名健康献髓者BMMNC用CD34+ 免疫磁珠(Stem cell公司)进一步分选收集CD34+细胞待用。采集静脉血，ACD-A抗凝，400×g离心10 分钟，分取血浆，置于-20℃冻存供检测用。

　　RT-PCR

　　总RNA的提取

　　用TRIzoL试剂盒(Gibco BRL)，按其说明书提取细胞总RNA。

　　cDNA的合成

　　取2 μg 总RNA，用随机引物(Gibco/BRL)及SuperScripⅡ试剂盒(Gibco BRL)，按说明书逆转录成cDNA后-20℃冻存待用。

　　PCR反应

　　针对Flt-3基因ITD突变主要发生在11号外显子和12号外显子之间，在11号外显子近端和12号外显子远端分别设计序列引物。阴性对照组为β-actin。引物序列如下：R5-Flt-3：5′-TGTCGAGCAGTAC TCTAAACA-3′;R6-Flt-3：5′-ATCCTAGTACCTT CCCAAACT-3′; β-actin-sense：5′-CTTCTACAAT GAGCTGCGTG-3′; β-actin-antisense：5′-TCATGAG GTAGTCAGTCAGG-3′。

　　PCR反应系统为50 μl 体系(cDNA 2 μl，引物浓度400 nmol/L，Taq酶1 U)，反应条件为：94℃ 10分钟，94℃ 变性1分钟，72℃ 延伸1分钟，59℃ 退火1分钟，共35个循环，最后72℃ 延伸1.5分钟。取10 μl PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，紫外线照相。

　　PCR产物鉴定及序列分析

　　用QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)回收纯化PCR产物，按ABI PRISM Big-Dye terminator cycle squencing ready reaction试剂盒(PE)说明书进行序列分析，所得序列资料在GenBank用BLAST Research软件进行同源序列搜索，确定PCR扩增产物进行分析。

　　结 果

　　各细胞系Flt-3的表达

　　野生型Flt-3 扩增产物为366 bp，发生Flt-3/ ITD 突变扩增出高分子量片段，约400 bp。通过Flt-3基因外显子11和12的PCR产物扩增和3%的琼脂糖凝胶电泳显示：所检测的57个ALL细胞株发现33个Flt-3基因阳性，阳性率为58%。各免疫亚型ALL细胞株检测阳性率为：c-ALL 76%(16/21)，pre-B ALL 67 %(6/9)，B-ALL 36 %(4/11)，T-ALL 44 %(7/16)。20个AML细胞株发现12个Flt-3基因检测阳性，阳性率60 %。各免疫亚型AML细胞株检测阳性率为：AML 56%(5/9)，AMOL 63%(5/8)。AMOL中1个PCR 扩增后在366 bp上方出现1条特异性条带。5个CML细胞株中3个(60%)Flt-3基因检测阳性(图1)。

　　B细胞系ALL细胞株分化度与Flt-3表达

　　按B细胞系ALL细胞株分化度统计，未分化B细胞30例中Flt-3阳性为22例，阴性为8例，阳性率为73%。各免疫亚型检测率分别为：c-ALL 94%(15/16)，pre-B ALL 67 % (6/9)。成熟B细胞ALL 27例中Flt-3阳性为11例，阴性为16例，阳性率为41%。各免疫亚型检测率分别为：B-ALL 36%(4/11)，T-ALL 43.7%(7/16)。统计学分析显示，未分化B细胞系Flt-3突变基因检测阳性率显著高于成熟，B细胞ALL ( P<0.05)，说明B细胞系ALL中细胞分化越成熟则Flt-3突变基因检测阳性率越低(表1)。Table 1. Expression rate of Flt-3 in several differentiation stags of ALL cell line(略)

　　Flt-3/ ITD测序

　　我们对其中1例PCR扩增后在366 bp上方出现1条特异性条带的AMOL细胞株进行序列分析。BLAST比较分析发现，其存在有29 bp的两个编码重复序列，ITD框内突变位于外显子11，未累及外显子12 (图2)。其余Flt-3表达阳性株均未见重复序列及其他突变(表2)。Table 2. Sequencing results of various cell lines(略)

　　讨 论

　　Flt-3是Ⅲ型酪氨酸激酶受体(RTKⅢ)成员之一，具有RTKm成员共同的结构：胞外5个免疫球蛋白样结构区、近膜区(JM)、穿膜的2个激酶区(TK1和TK2)[由1个激酶插入区(KI)分隔]、C-端胞内区[3]。正常情况下，Flt-3的表达仅仅限于CD34+ 的造血干细胞，其配体为FL (Flt-3 ligand)。无配体存在时，近膜结构域对Flt-3二聚体形成和活化起着抑制作用，当配体FL与Flt-3受体结合，后者发生二聚体化，使得激酶结构域的构象发生改变，酪氨酸残基磷酸化，RAS2GAP、PLC2γ、PI32激酶、STAT5和ERK1/ 2等底物蛋白被激活，通过一系列细胞内信号传递，细胞增殖信号转导入细胞核，从而使造血干细胞发生增殖和活化[4]。近年来研究发现，70%-100%急性髓细胞白血病(AML )，50% 以上急性淋巴细胞白血病(ALL ) 及慢性髓细胞白血病(CML ) 加速期、急变期Flt-3高表达[5]。本实验结果表明，58%的ALL细胞株(c-ALL 76%，pre-B ALL 67 %，B-ALL 36 %，T-ALL 44 %)Flt-3表达阳性，与国内外文献报道的50%以上相符。而60%的AML细胞株(AML 54.5%，AMOL 62.5%)Flt-3表达阳性虽低于国内外文献报道的70%-100%水平，但与我们的前期工作的结果基本相同[6，7]。经综合分析，我们认为其原因可能是国内外文献报道的都是临床试验的结果，而我们采用的是细胞系。这也说明了体内和体外实验由于对象不同，结果会有所差异。

　　Flt-3跨膜区内部串联重复( ITD) 突变是近年来发现的Flt-3基因最常见的一种突变类型。目前许多国内外研究发现在AML患者中存在ITD突变[8，9]。1996年Nakao等[10]首次报道AML细胞中存在Flt-3基因跨膜区 ITD 突变，发生部位为外显子11和12。随后的研究证明，Flt-3/ITD主要发生在AML，大约15 %-35 %的AML存在Flt-3/ITD突变，并见于AML各亚型，其突变率各异。在骨髓增生异常综合征患者Flt-3基因ITD突变的发生率分别为5 %和10 %。在儿童急性白血病中两者的发生率分别为11.15 %和15.14 %。最近，Take-tani等[11]报道，混合谱系白血病(mixed lineage leukemia，MLL)细胞基因重组和高倍体染色体的ALL婴儿，常常存在Flt-3基因突变。本实验结果表明，尽管58%的ALL细胞株和60%的CML细胞株存在Flt-3异常表达，但测序结果都没有发现Flt-3/ ITD突变。仅AML存在Flt-3/ITD突变。这说明Flt-3/ITD仅发生于AML，而不发生在ALL。该结果与以往报道相同[7，8]。

　　大量的临床资料提示，Flt-3异常活化与临床上高白细胞、高复发率、患者预后不良有关[12]。Flt-3基因突变致发AML的机理仍未阐明。一方面，酪氨酸激酶异常活化引起的细胞因子非依赖性细胞增殖与疾病发生密切相关[13]，另一方面ITD是如何造成配体非依赖型Flt-3活化的原因目前尚未明确。据推测，ITD可能减弱了近膜结构域正常的自抑制作用，或是干扰了近膜结构域内在的自身负调节效应，使Flt-3受体的空间结构发生改变，暴露出酪氨酸激酶结构域磷酸化结合位点，启动信号转导级联[14]。本研究1例ITD中，除JM 结构域外，未累及激酶结构域起始翻译位点E608，但存在1个29 bp的重复序列，提示ITD仅局限于JM结构域，推测其作用机制可能与酪氨酸残基的复制相关。

　　越来越多的学者关注Flt-3基因，期待在治疗白血病方面有所突破。我们已开始利用Flt-3基因载体进行白血病的实验治疗研究，通过观察白血病细胞生长状态及小鼠生存期的变化来评价Flt-3基因治疗白血病的疗效。

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