5-羟色胺对巨核系造血的影响

　　作者：程源山,刘元生,杨默　　作者单位：汕头大学医学院第一附属医院血液科，汕头 515041

　　【摘要】5-羟色胺(5-HT)是一种细胞生长因子，主要结合到细胞表面的5-HT1受体、5-HT2受体，通过Ras、MAPK通路促进多种细胞的增殖。在巨核系造血的早期，5-HT通过5-HT2B受体促进造血干细胞及巨核系祖细胞增殖和分化，其具体机制尚未十分清楚;在巨核系造血晚期，5-HT与5-HT2A受体结合促进一氧化氮合成，可能对血小板的释放有一定的影响。另外，5-HT能够对抗血小板α颗粒内容物血小板反应蛋白-1(TPS-1)所引起的巨核细胞凋亡，协同另一内容物血小板源性生长因子(PDGF)引起的巨核细胞增殖，因此5-HT可能是血小板反馈调节中比较重要的物质。本文就5HT及其受体、5HT是细胞生长因子、5HT促进细胞增殖的途径及5HT对巨核系祖细胞的影响进行了综述。

　　【关键词】 5-羟色胺

　　Abstract 5-hydroxtryptamine (5-HT，serotonin) has been recognized not only as a neurotransmitter and vasoactive agent，but also as a growth factor.5-HT mainly binds to 5-HT2 receptors or 5-HT1 receptors on cell surface to stimulate cell proliferation through Ras or MAPK pathway in many cell types.It has been reported that 5-HT stimulates megakaryocytopoiesis via 5-HT receptors.The possible mechanism of 5-HT on the proliferation and differentiation of megakaryocytes (MK) has been discussed in this review article.In early stage of megakaryocytopoiesis，5-HT may bind to 5-HT2B receptor on megakaryocytes，and promotes their proliferation and differentiation.In the late stage，5-HT may involve in the platelet release procedure by inducing nitric oxide (NO) synthesis via 5-HT2A receptors.5-HT can also antagonize the apoptotic effect induced by thrombospondin-1 (TSP-1) which is a platelet α granule protein and has synergic effect with platelet-derived growth factor (PDGF) to enhance megakaryocytes proliferation.Therefore，5-HT is likely to be an important substance in the feedback regulation of thrombopoiesis. In this review the 5-HT and its receptors，5-HT as cell growth factor，pathway of 5-HT stimulating cell proliferation and influance of 5-HT on MK-progenitor cells were summarized.

　　Key wards 5-HT; serotonin; megakaryocytopoiesis; platelet

　　5-羟色胺(5-hydroxtryptamine，5-HT)，早在1941年就由Rapport等从血清中分离出来，是一种具有缩血管活性的物质，并命名为血清紧张素，简称血清素(serotonin)。5-HT既是一种血管活性物质，又是一种神经递质，在中枢及周围神经系统起着重要的生理功能。1986年Nemecek等[1]首先报道5-HT对血管平滑肌细胞的增殖有促进作用;1996年Yang等[2]报道5-HT能促进巨核细胞增殖，因此认为5-HT也是一种细胞生长因子[3]。本文拟从5-HT促进细胞增殖及其对巨核细胞的影响方面作一综述。

　　5-HT及其受体

　　5-HT是一种吲哚胺类化合物，化学结构由吲哚和乙胺组成，其化学式为C10H12N2O，分子量176.2 Da。人体中的5-HT，90%存在于消化道黏膜的嗜铬细胞，8%-10%存在于血小板内，1%-2%存在于中枢神经系统，肥大细胞中也含有少量的5-HT。由于5-HT不能透过血脑屏障，所以外周和中枢的5-HT分属两个不同的系统。肠黏膜的嗜铬细胞含有色氨酸羟化酶，能够合成5-HT。游离到血浆的5-HT被血小板摄取，贮存于血小板的致密颗粒。血小板虽然含有低活力的色氨酸羟化酶，但其5-HT主要来源还是血浆中的5-HT。当血管壁破损时，血小板中的5-HT随同其他促凝血物质释放到血液，引起周围微血管收缩和血小板聚集以及启动一系列凝血过程。血小板中5-HT 的半存期约4.2天，为血小板寿命的一半。5-HT主要是通过单胺氧化酶(MAO)的作用氧化成5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)降解排出。

　　5-HT受体(5-HTR)数目众多，到目前为止5-HT受体已经证明有7个类型15个亚型以上。这些受体大部分分布在神经组织，但是在其他外周组织，这些受体也有重要的生理功能，5-HT 复杂的生理功能大部分就是通过这些受体介导的。5-HTR大部分已经被克隆。除了5-HT3R为配体门控离子通道蛋白外，其余都属于G蛋白偶联受体家族。其中5-HT1R分为5-HT1AR、5-HT1BR、5-HT1DR、5-HT1ER、5-HT1FR 5种亚型，5-HT2R又分为5-HT2AR、5-HT2BR和5-HT2CR 3种亚型。对于涉及细胞增殖而言，5-HT2BR、5-HT2CR、5-HT2AR 、5-HT1AR、5-HT1BR是比较重要的受体亚型。

　　5-HT转运蛋白(5-hydroxtryptamine transporter，5-HTT或serotonin transporter，SERT)是一种有别于5-HT受体的细胞膜蛋白，两者的不同已经由两者的cDNA以及不同的拮抗剂(抑制剂)所证实，5-HTT在神经递质的传递中起到重要作用，其选择性再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRI)是一类重要的抗抑郁症药物，在外周组织细胞表面也存在5-HTT介导5-HT的摄取，并且有学者认为5-HTT介导的5-HT内化对细胞的增殖也有重要的作用[4-6]。

　　5-HT是细胞生长因子

　　1986年Nemecek等[1]首次报道5-HT对血管平滑肌细胞的增殖有促进作用，其后，诸多学者对不同的细胞进行研究，证实5-HT对包括成纤维细胞、神经元及神经胶质细胞、成骨细胞、肾小球系膜细胞、上皮细胞、巨核细胞等多种细胞的有丝分裂有促进作用[2]，因此认为5-HT是一种细胞生长因子。5-HT对细胞有丝分裂所起的作用较早，Vesela等[7]报道鼠卵母细胞、受精卵、双细胞胚期(2-cell embryos)就可以检测到5-HT1DR mRNA的表达，并且5-HT1DR拮抗剂对胚胎的发育有明显抑制作用。Choi等[8]在鼠卵子受精后第8天检测到5-HT2BR mRNA的表达，第9天受精卵表面细胞膜就表达5-HT2BR蛋白，并且胚胎早期心肌和神经上皮有摄取5-HT的能力，5-HT对胚胎心血管系统[9]，神经系统，颅面的发育有较大影响。对造血干细胞，Yang等[10]报道5-HT能够促进脐血来源的CD34+细胞、CD34+CD38-细胞的体外扩增。如前所述，5-HT能够促进组织细胞的增殖，该作用大部分是由5-HT受体介导的，但是5-HT受体数目众多，且功能多有重叠，主要介导5-HT促进细胞有丝分裂的受体有5-HT2BR、5-HT2CR、5-HT2AR 、5-HT1AR、5-HT1BR，到底哪些类型主要介导5-HT的有丝分裂促进作用，现在看起来似乎和细胞类型有关。5-HT2BR 表达在心肌、血管平滑肌、肠神经节、骨膜纤维及成骨细胞上，5-HT 激活该受体，促进细胞分裂增殖[11-13]。Seuwen等[14]则报道在中国仓鼠肺的成纤维细胞5-HT主要是通过5-HT1BR促进DNA的合成;Grewal等[15]认为，5-HT对肾小球系膜细胞的增殖作用主要由5-HT2AR所介导;而Guillet-Deniau等[16]也发现骨骼肌上有5-HT2AR表达，5-HT也能通过该受体调节细胞的增殖。上述其他受体也表达在细胞表面，有些虽然不起主要作用，但也有较弱的促进细胞有丝分裂的功能或者代偿功能，这和受体蛋白的结构以及传导通路相似有关。此外，尚有人认为5-HTT也有介导促进有丝分裂的作用，但尚未得到充分证实。

　　5-HT促进细胞增殖的途径

　　由于5-HT受体类型众多，受体功能多有重叠，因此5-HT刺激细胞增殖的途径和细胞内信号的传导尚存在许多争议。5-HTR除了5-HT3R以外都属于GPCR，对细胞增殖比较重要的是1型和2型受体，其中5-HT1R以cAMP为第二信使;而5-HT2R则是以IP3/DG为第二信使，两类受体都是通过激活酪氨酸激酶以及通过Ras、MAPK通路促进细胞的增殖。

　　5-HT受体具体的细胞内信号的传导尚未十分清楚，2000年，Nebigil等[17]比较详细的报道了5-HT2BR的细胞内信号传导过程，他们认为5-HT和5-HT2BR结合后顺序激活G蛋白和磷脂酶C，释放三磷酸肌醇，使细胞内钙升高，激活MAPK/ERK1、ERK2以及Src家族激酶c-Src。他们认为，细胞周期蛋白(cyclin)D1的表达受MAPK活性的控制，而cyclin E的表达则受c-Src的影响，同时血小板源性生长因子受体(PDGFR，一种受体酪氨酸激酶)的磷酸化影响MAPK和cyclin D1的形成，反过来c-Src的活性又影响PDGFR的磷酸化。生成的cyclin D1 和cyclin E则分别和其催化亚基形成cyclin D1/cdk4和cyclin E /cdk2复合物调控细胞周期或使Rb(retinoblastoma)蛋白过磷酸化，参与细胞周期的调节(附图)，因此他们认为，c-Src在调控5-HT2BR引起的细胞增殖有重要作用，它单独调控了cyclin E的表达，又通过影响PDGFR的磷酸化间接的调控了MAKP/ERK途径的cyclin D1表达。

　　Lee等[18，19]人则认为超氧化物O2-及其代谢物H2O2是介导5-HT产生促增殖作用的重要物质，他们认为，5-HT与其受体或转运蛋白结合后，能够激活P21RAS，通过NAD(P)H氧化酶途径产生内源性O2-，内源性O2-及其经超氧化物歧化酶(SOD)代谢后的产物H2O2能够激活MAPK，特别是ERK1/ERK2，然后引起细胞生长增殖。但是5-HT是通过与5-HT受体还是与5-HTT结合引起上述生物学效应，现在尚存在争议，Lee等[18]则观察到5-HTR和5-HTT两者都可以参与上述过程，具体取决于细胞类型，Greene等[20]也证实了5-HT2AR是通过该过程激活MAPK。最近，Liu等[21]报道，5-HT 能够通过5-HT1BR、5-HT1DR激活Rho激酶(ROCK)，然后通过cyclin D1、转录因子Egr-1、GATA-4的表达以及Elk磷酸化促使细胞进入增殖状态。

　　5-HT对巨核系祖细胞的影响

　　5-HT和血小板以及巨核细胞关系密切，血液中的5-HT约98%贮存于血小板中，血小板能够摄取血液中的5-HT，并且保存在其中的致密颗粒。当血小板被破损的血管壁激活时，血小板能够释放5-HT以及PDGF等其他凝血物质，5-HT通过5-HT2R使血小板聚集。血小板的前体细胞巨核细胞也能够摄取5-HT，并且是骨髓唯一能够摄取5-HT的细胞类型[22]。

　　1996年Yang[2] 等首次报道5-HT通过5-HT2R受体促进巨核细胞增殖，他们认为100 nmol/L的5-HT对巨核细胞有最佳的刺激效应，并且该效应和PDGF、IL-11等细胞因子的作用协同。同时，他们也指出虽然巨核细胞对5-HT的摄取能力已经完善，但是对5-HT的储存尚未完全成熟。巨核细胞中存在单胺氧化酶(MAO)能够代谢5-HT [22]。最近[3，23，24]，他们又证实了在大部分(80%-99%)的巨核细胞及巨核系祖细胞细胞表面存在5-HT2A、5-HT2B、5-HT2C受体，并且5-HT能够提高培养巨核细胞的体积[3，23，24]，可见5-HT对巨核小板的分化成熟也有一定的作用。血小板的生成和释放是巨核细胞最后阶段，有学者认为，血小板生成和释放与巨核细胞的凋亡密切相关，一氧化氮(NO)在这个过程起着重要作用，5-HT和5-HT2A受体结合产生O2-的过程也促进NO的产生，因此5-HT可能通过5-HT2B受体促进细胞的增殖，而通过5-HT2A受体使细胞成熟，促进血小板的生成和释放[3]。巨核细胞和其他系的血细胞一样都起源于造血干细胞(hemopoietic stem cell，HSC)，更深入的研究表明，5-HT不仅对于巨核细胞，对于造血干/祖细胞的增殖也有促进作用，5-HT能够促进脐血来源的CD34+细胞、CD34+CD38-细胞、CD41+CD61+细胞体外扩增和巨核系集落形成单位(CFU-MK)，混合多系集落形成单位(CFU-GEMM)形成。5-HT2A、5-HT2B、5-HT2C受体同样表达在CD34+细胞表面，虽然其含量只占CD34+细胞总数的1%。更重要的是5-HT能够提高CD45+细胞和CD33+细胞在NOD/SCID小鼠的植入[3，10]。体内造血一个重要的过程就是细胞间的接触和信号分子的传递，在这个过程中骨髓间质细胞和细胞外间质的作用已经被广泛证实。Sung等[25]的研究认为，骨髓间质细胞表面同样有5-HT2A、HT2B受体存在，并且5-HT能够刺激鼠CFU-F形成，作用和PDGF 、VEGF相近但弱于FGF-2。并且他们之间有协同作用[26]。

　　5-HT对巨核细胞增殖的促进作用尚未完全阐明，可能通过如下几个机制： ①5-HT和巨核细胞表面的5-HT2B受体结合，启动cyclin D1/ cyclin E/Src/MAPK途径使细胞进入增殖状态; ②5-HT促进纤维细胞等骨髓基质细胞增殖和产生TPO，提高局部的TPO浓度，从而正性调控巨核系造血; ③5-HT能够促进造血干细胞进入核酸合成和细胞分裂周期，通过提高造血干/祖细胞的数量刺激巨核系造血。

　　另外，PDGF和5-HT 关系十分密切，两者都存在于血小板，并且一起释放入血，两者在细胞内信号传导过程中相互影响。Yang等[27]证明巨核细胞表面存PDGF受体，PDGF对CD34+细胞、巨核细胞的体外扩增有促进作用。5-HT和PDGF在功能上协同，能够协同提高巨核细胞数量 [28-30]。甲磺酸伊马替尼通过抑制费城染色体编码的Bcr-Abl酪氨酸激酶而被用于治疗CML，但它同时也抑制PDGFR和c-Kit两种酪氨酸激酶的活性而造成一定程度的白细胞减低和血小板减少(42%)[31]，由于5-HT和PDGF传导通路的相关性，5-HT有可能改善这种血小板减少。血小板反应蛋白1 (thrombospondin-1，TSP-1) 能够通过CD36使巨核细胞发生凋亡，是一种巨核系负性调控因子，5-HT能够抑制TSP-1介导的MK凋亡，该过程可能是通过 5-HT2B受体途径实现的[24，32]。值得注意的是，一氧化氮(NO)也能够促使巨核细胞凋亡，但该过程伴随血小板的释放，5-HT可能是通过5-HT2A受体增加NO合成，影响血小板的释放 [3，33]。

　　巨核系造血是一个复杂的多阶段的过程，包括巨核系祖细胞增殖和分化为巨核细胞以及巨核细胞成熟产生血小板两个阶段。现已证明，前一个阶段为TPO、IL-1β、IL-3等早期作用细胞因子的调节，TPO、IL-11、IL-6等细胞因子调节后一个阶段。此外，可能有一个血小板参与的反馈调节机制来调控巨核细胞的增殖和血小板的释放来保持外周血小板的稳定。我们认为5-HT是该反馈调控机制的重要物质。血小板的α颗粒含有PDGF、血小板第四因子(PF4)、TSP-1等物质，血小板致密颗粒含有5-HT，在凝血过程中这些物质被释放，参与凝血过程，同时也可能是一种反馈调节，PF4 和TSP-1是负性调控物质[34]，PDGF、5-HT为正性调控物质[27，28]，而5-HT可能还能控制NO引起的血小板释放，血小板也通过受体介导的内化功能调节TPO的血浆浓度，因此血小板可以通过摄入及释放上述物质来调控巨核细胞的增殖以及血小板的释放。

　　问题和展望

　　5-HT是一种古老的生物分子，它不仅仅作为神经递质和血管活性物质，还是一种细胞生长因子，对胚胎以及组织细胞都有作用，其生物功能十分复杂，因此在5-HT 对细胞的增殖及巨核细胞影响方面，尚存在许多疑问：5-HT对巨核系祖细胞有正性调控作用，但是其具体机制究竟如何? 5-HT又是从哪些方面促进巨核细胞的分化?对其他血细胞有何作用?对血小板的释放有无影响?这些方面的深入研究，相信有助于理解巨核细胞的增殖和血小板的释放，以及理解其调控机制。

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