丙戊酸钠对肿瘤细胞影响的体外研究

　　作者：马洪玉,李际君　　作者单位：061001 河北省沧州市中心医院血液内科

　　【摘要】目的以K562细胞为研究对象,观察丙戊酸钠体外(VPA)对肿瘤细胞的影响,以进一步指导VPA用于白血病的治疗。方法 (1)应用MTT实验研究VPA对肿瘤细胞增殖抑制实验。(2)应用ELISA方法检测VPA诱导K562细胞株细胞凋亡的作用。结果 (1)VPA对K562细胞增殖表现出很明显的抑制作用，且在0.1～100 mg/ml范围内增殖抑制作用有明显的量效关系。(2)作用时间越长VPA促肿瘤细胞凋亡的现象越明显，各时间段结果比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 VPA对K562细胞具有增殖抑制作用,且作用具有显著的浓度依赖性。进一步的实验证实，高浓度VPA对K562细胞增殖抑制的的机制是通过诱导细胞凋亡实现的,且促凋亡作用有显著的时间依赖性。

　　【关键词】 丙戊酸钠,K562 白血病,凋亡

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of VPA on human leukemia cell line K562 in vitro in order to make further guidance in VPA's treatment of leukemia.Methods (1)Research inhibit of VPA effect to the propagation of the tumor cells by using MTT method.(2)Use the method of ELISA to examine the effect of VPA on inducing K562 cells' apoptosis.Results (1) VPA shows obvious effect on restraining K562 cells' proliferation, and this effect has distinct quantityeffective relation within the scope of 0.1～100 mg/ml. (2) With the extending of the time, the phenomenon of the apoptosis of the tumor cells becomes more obvious, and the results in different periods show obvious differences.Conclusion It proved that VPA may inhibit the proliferation of the K562 cells, with a dusedependent manner. Further experiment approved that higher dose of VPA can restrain the proliferation of the K562 cell through inducing its apoptosis, and its effect is closely related to time.

　　【Key words】 VPA; K562; leukemia; apoptosis

　　丙戊酸钠(valproic acid,VPA) 属于短链脂肪酸( SCFA)家族，是临床上广泛应用的广谱抗癫痫药，近年来被发现其具有抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, 组蛋白去乙酰化酶)活性的作用，属于组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylase inhibitor, 组蛋白去乙酰化酶I)，同时还发现VPA可阻碍血管生成、抑制转移，从而达到治疗肿瘤的目的，其潜在的抗肿瘤作用受到极大关注，有望成为肿瘤治疗的突破性药物。本研究以 K562细胞为研究对象,观察VPA体外对肿瘤细胞的影响,以进一步指导VPA用于白血病的治疗。

　　1 实施材实

　　1.1 肿瘤细胞株与培养

　　人白血病细胞株K562，由河北医科大学第四医院科研中心提供。

　　1.2 试剂

　　VPA纯品为Sigma产品，纯度99.8%,分子式为C8 H15NaO2,以去离子水配制成20 mg/ml 浓度,过滤分装,贮存于-20℃。组蛋白Histone ELISA试剂盒购于LIFEKEY公司。

　　1.3 实验仪器

　　BBLOCELL HT系列酶标仪郑州博塞生物工程有限责任公司生产,型号:2010型。

　　2 方法

　　2.1 VPA对肿瘤细胞增殖抑制实验[1，2]

　　2.1.1 实验分组：对照组：在细胞培养体系中加入PBS 10 μl。实验组：在细胞培养液中加入10 μl(分别为0.1、1.0、10、20、50和100 mg/ml)VPA稀释液。

　　2.1.2 实验步骤：收集对数生长期肿瘤细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml接种于96孔培养板，每孔100 μl，分别加入对照剂和VPA稀释液，每组5个复孔。5%CO2，饱和湿度，37℃培养72 h。每孔加MTT(5 mg/ml)10 μl，继续培养4 h。弃去培养上清，每孔加10% DMSO 100 μl，震荡15 min。酶联免疫检测仪检测OD 492 nm值，计算抑制率。抑制率(%)=(空白对照组OD值实验组OD值)/空白对照组OD值×100%。

　　2.2 ELISA方法检测VPA诱导K562细胞株细胞凋亡的作用[3，4]

　　2.2.1 实验分组： 对照组：在细胞培养体系中加入PBS 100 μl。实验组：在细胞培养液中加入100 μl(100 mg/ml)VPA稀释液。

　　2.2.2 细胞处理及试验步骤： 取对数生长期K 562细胞,以5.0×105个/ml浓度接种于24孔板，每孔1.0 ml，分别加入对照剂和VPA，每组设4个复孔。培养24、48、72 h。加入细胞裂解液(Tris.cl pH8.010 mmol/L, Nacl 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, 蛋白酶K 100 mg/L, SDS 10 g/L)200 μl，4℃裂解30 min。15 000 r/min离心15 min，吸取上清液，备用。ELISA试剂盒和酶标板提前于室温放置30 min。加入100 μl质控品、100 μl校正液、100 μl待测样品、100 μl阴性对照样品、100 μl本底(细胞裂解液)至适当酶标板孔中，室温放置30 min;甩尽孔内液体，每孔加洗涤液300 μl，静置30 s后甩尽液体，拍干，重复5次;每孔加入酶联物100 μl(本底孔除外)，静置30 s，封住板孔，室温放置30 min;甩尽孔内液体，每孔加洗涤液300 μl，静置30 s后甩尽液体，在厚叠吸水纸上拍干，重复5次;每孔加入显色液100 μl，室温15 min;每孔加入终止液100 μl，混匀，测OD450值。

　　2.3 统计学分析

　　计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　3 结果

　　3.1 对K562细胞体外的增殖抑制活性

　　VPA对K562细胞增殖表现出很明显的抑制作用，且在0.1～100 mg/ml范围内增殖抑制作用有明显的量效关系，见图1。

　　3.2 VPA对肿瘤细胞凋亡的影响

　　如图2所示, 随作用时间的延长，VPA促肿瘤细胞凋亡的现象越明显，各时间段结果之间比较差异有统计学意义(P<0.01)。

　　4 讨论

　　VPA一直以来用于癫痫的治疗,毒副作用较小。它是短链脂肪酸的一种,也属于HDAC抑制剂。目前国外有研究发现VPA有可能用于抗肿瘤治疗;同时VPA对Pgp和(或)MRP1阳性的急性髓系白血病细胞同样存在抑制增殖和促凋亡作用,所以VPA可能会对多药耐药细胞也有作用。另外，单用VPA治疗19例MDS和继发于MDS的AML,其中有8例显效，所以VPA是一个具有应用前景的药物。但是,VPA用于白血病治疗的临床试验笔者还未见报道,而且VPA治疗白血病的作用机制及其临床疗效尚待进一步研究[5-8]。

　　细胞凋亡时，细胞染色体DNA断裂，断裂的DNA与组蛋白H2A,H2B,H3和H4紧密结合，形成核小体，保护其DNA不继续被核酸内切酶降解。本研究采用抗组蛋白抗体和抗DNA抗体夹心法进行测定，用抗组蛋白抗体包被酶标板，加入含有核小体和寡聚核小体的凋亡裂解物，然后加入POD标记的抗DNA抗体，此抗体可与已固定的核小体或寡聚核小体中的DNA结合，显色后，通过酶标仪分析，可定量测定凋亡细胞[9]。

　　为了进一步明确VPA 的抗白血病作用, 为VPA 应用于临床治疗白血病提供有力的证据,本实验以K562细胞为靶细胞, 观察VPA对K562细胞的影响。MTT法证实VPA对K562细胞在0.1～100 mg/ml浓度区间内具有增殖抑制作用,且作用具有显著的浓度依赖性。进一步的实验证实，高浓度剂量VPA对K562细胞增殖抑制的的机理是通过诱导细胞凋亡实现的,且促凋亡作用有显著的时间依赖性。关于低浓度剂量VPA对K562细胞诱导分化为DC的研究将另文报道。

　　【参考文献】

　　1 Islam MM，Begum S，Lin L，et al. Synergistic cytotoxic effect between serinethreonine phosphatase inhibitors and 5fluorouracil: a novel concept for modulation of cytotoxic effect.CancerChemotherPharmacol，2002，49:111118.

　　2 Zeisig R，Stahn R，Teppke AD,et al. Cancerostatic octadecylpiperidinoylphosphate liposomes: effect of composition on uptake by and toxicity to J774 mouse macrophage cells and MT1 breast cancer cells in vitro. Anticancer Drug Des，2001，16:1926.

　　3 Sadava D,Phillips T, Lin C，et al.Transferrin overcomes drug resistance to artemisinin in human smallcell lung carcinoma cells.Cancer Lett，2002，179:151156.

　　4 严匡华,尤胜国,卞寿庚,等.细胞因子体外诱导急性髓系白血病细胞分化为树突状细胞.中华血液学杂志,2003,24:365368.

　　5 Owcns MJ,Nemeroff CB.Pharmacology of valproate.Psychupharmacol Bull.2003,37:1724.

　　6 Strahl RD，Albs CD.The language of oarvalent hstone modifioations.Nature，2000,403:4145.

　　7 Marks P,Kifkind HA,Nichnn VM,et al.Histone deacetylases andcancer; causes and therapies.Nat Rrv Cancer,2001，1:194202.

　　8 Gmvich N,Tsygaukova OM, Meinkuth JI，et al. Histone daacetvlase is a target of valproLC acidmediated cellular differennanon.Cancer Res,2004，64:10791086.

　　9 温进坤，韩梅主编.医学分子生物学理论与研究技术.第1版.北京：科学出版社，2002.268270.