体外培养的人AGM区基质细胞表达多种造血生长因子

　　作者：陈惠芹,张绪超,唐新意2,吴北燕,黄绍良　　作者单位：1中山大学附属第二医院干细胞研究中心， 广州 510120; 2中山大学附属第三医院儿科，广州 510630; 3广东省人民医院肺癌研究所、医学研究中心， 广州 510310

　　【摘要】本研究检测人胚胎主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞表达的造血生长因子，为探讨AGM区基质细胞在胚胎造血发生中的作用及其造血支持作用提供基础资料。采用RT-PCR方法在mRNA水平分析IL-6、SCF、Flt3-L、OSM、IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子在人AGM区基质细胞(hAGMS1-S5)的表达情况，应用ELISA法测定IL-6、SCF、Flt3-L在hAGMS1-S5细胞培养上清液中的分泌水平，并将脐血CD34+细胞与hAGMS1-S5饲养层细胞共培养14天后行造血细胞集落培养以进一步检测人AGM区基质细胞的造血支持作用。结果表明： hAGMS1-S5均表达IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生长因子mRNA，不表达IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA。在hAGMS1-S5细胞培养上清液中可测得分泌的SCF、Flt3-L、IL-6等因子，hAGMS1-S5组间比较各因子水平无显著性差异(P>0.05)。集落培养结果表明，hAGMS1-S5对CFU-GM、BFU-E 、CFU-Mix均有不同程度的扩增作用， hAGMS1-S5的造血支持作用组间比较亦显示有显著性差异(P<0.05)，其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5。结论： 人AGM区基质细胞表达SCF、Flt3-L、IL-6、OSM等多种造血生长因子，这可能与AGM区基质细胞支持造血细胞原始发生和体外维持造血干细胞功能相关。

　　【关键词】 主动脉-性腺-中肾区,基质细胞,造血生长因子

　　AbstractThis study was aimed to investigate the hematopoietic growth factors expressed in human aorta-gonad-mesonephros (AGM)-derived stromal cells in vitro in order to provide the basic data for elucidating the role of AGM -derived-stromal cells in embryo-hematopoiesis and its hematopoietic suppoitive effect. RT-PCR was used to analyze the expression of IL-6, SCF, Flt3-L, oncostatin M(OSM), IL-3, TPO, M-CSF and LIF in human aorta-gonad- mesonephros-derived stromal cells (hAGMS1-S5) at mRNA level. IL-6, SCF and Flt3-L levels were detected in the supernatant of hAGMS1-S5 stromal cells by ELISA assay. Umbilical cord blood CD34+ cells were cocultured with hAGMS1-S5 feeder cells , and hematopoietic cells were collected at day 14 for colony analysis in methylcellulose semisolid medium. The results showed that human aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells S1-S5 expressed IL-6, SCF, Flt3-L and OSM mRNA, but did not express IL-3, TPO, M-CSF and LIF mRNA. In the supernatant of hAGMS1-S5 cells, IL-6, SCF and Flt3-L could be detected by ELISA assay at different levels, while there was no significant difference between groups of hAGMS1-S5 (P>0.05). When cocultured with umbilical cord blood CD34+cells, hAGMS1-S5 could support the expansion of CFU-GM, BFU-E, and CFU-Mix. The supportive effects of hAGM S1-S5 were significantly different (P<0.05), hAGM S3 and S4 were better than hAGM S1, S2, and S5. It is concluded that detection of hematopoietic growth factors expressed in human aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells provided a solid foundation to elucidate the mechanism of hematopoiesis and the hematopoietic supportive effect of these stromal cells.

　　Key wordsaorta-gonad-mesonephros; stromal cell; hematopoietic growth factor

　　近年研究表明，主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros， AGM)区是哺乳动物胚胎期永久造血(definitive hematopoiesis)的起源部位，该区的造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)具有向粒系、红系、淋巴系等造血各系分化的能力[1-3]。作为多潜能HSC出现的最早部位，AGM区具有胚胎造血发生发育所需的重要微环境，正成为国际上造血发生、分化机制研究中的热点。本研究首次对体外培养中的人胚胎AGM区基质细胞表达的造血生长因子进行了检测，为探讨AGM区造血微环境在胚胎造血发生中的作用及其造血支持作用研究提供基础资料。

　　材料和方法

　　主要试剂

　　α-MEM、马血清、β-巯基乙醇、Glutamax-I(Gibco公司产品)，胎牛血清(Hyclone公司产品)，氢化可的松、丝裂霉素C(Sigma公司产品)，总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒(Invitrogen公司产品)，琼脂糖、DNA分子量标记(Biolabs公司产品)，人IL-6、SCF ELISA 试剂盒(晶美生物工程有限公司产品)，人Flt3-L ELISA试剂盒(R&D Systems公司产品)， CD34+细胞分选试剂盒(德国Miltenyi Biotec公司产品)，造血细胞长期培养基MethoCultTM H5100及造血祖细胞集落培养基MethoCultTM GF+ H4435(加拿大Stem Cell 公司产品)。

　　人AGM区基质细胞的培养

　　收集经米非司酮及米索前列醇药物流产的30-35天的人胚胎，按本室方法，已建立5株人AGM区基质细胞，分别命名为hAGMS1-S5[4]。分别取第5代的hAGMS1-S5细胞，接种至25 cm2培养瓶，其中培养液含有20%胎牛血清、5%马血清、10 μmol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L Glutamax-I及1 μmol/L 氢化可的松的α-MEM。并置于37℃、5% CO2和饱和湿度培养箱中培养。

　　造血生长因子mRNA表达的RT-PCR检测

　　使用TRIZOL试剂，按说明分别提取hAGMS1-S5细胞总RNA。逆转录反应按试剂盒操作说明进行。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列分别为SCF：上游5′- GTCATTGTTGGATAAGCGAGAT -3′，下游5′-ATGGCTGCCCAGTGTAGG-3′，PCR产物长度为457 bp; Flt3-L：上游5′- CTGGAGCCCAACAACCTATCT -3′，下游5′- CCAGCGACAGTCTTGAGCC -3′，PCR产物长度为252 bp; IL-3：上游5′- TTTGCCTTTGCTGGACTT -3′，下游5′- TTCCAGTCACCGTCCTTG -3′，PCR产物长度为222 bp; IL-6：上游5′- GAGGGCTCTTCGGCAAAT -3′，下游5′- CTGGCTCTGAAACAAAGGATAT -3′，PCR产物长度为313 bp; M-CSF：上游5′- TGCGTCCGAACTTTCTATG -3′，下游5′- CACTGCTAGGGATGGCTTT -3′，PCR产物长度为202 bp; TPO：上游5′- ATTGCTCCTCGTGGTCAT -3′，下游5′- CTCCTCCATCTGGGTTTT -3′，PCR产物长度为220 bp; LIF：上游5′-CCGCATAGTCGTGTACCTT-3′，下游5′- ATTTGGGTTTAGCGATGC-3′，PCR产物长度为399 bp; OSM：上游5′- GCTGGACAACTCAGACACG -3′，下游5′- AACACGGAAAGGAGGAAGT -3′，PCR产物长度为697 bp。 PCR扩增条件： 94℃预变性2分钟，然后94℃变性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳后观察结果。

　　造血生长因子水平的ELISA检测

　　分别取第5代的hAGMS1-S5细胞接种于24孔板，每样本复种3孔，每孔培养体系1 ml。培养至细胞融合达70%-80%时换液，继续培养48小时，收集培养液，离心后取上清，分装，贮于-20℃备用。按ELISA试剂盒操作说明测定hAGMS1-S5细胞培养上清中IL-6、SCF和Flt3-L水平。

　　脐血CD34+细胞与hAGMS1-S5饲养层细胞共培养后的集落形成能力分析

　　分别取第5代的hAGMS1-S5细胞，接种至24孔板，细胞融合达80%-90%时予丝裂霉素C(浓度10 μg/ml)处理2小时，经PBS洗3次后加基质细胞培养液，置于37℃、5% CO2和饱和湿度培养箱中备用。采集本院产房出生的正常足月新生儿的脐血，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心分离得到脐血单个核细胞后，按照CD34+细胞分选试剂盒说明，采用免疫磁珠法进行CD34+细胞的分离纯化。将纯化的脐血CD34+细胞按2.0×104/孔接种于已制备好hAGMS1-S5饲养层的24孔板中进行共培养，根据培养体系中饲养层的种类不同分为6组：无饲养层组(对照组)、hAGMS1-S5饲养层组，培养液均为含1 μmol/L 氢化考的松(hydrocortisone)的H5100(其成分为α-MEM含125%胎牛血清、125%马血清、10 μmol/L 2-巯基乙醇、2 mmol/L L-谷胺酰氨、0.2 mmol/L i-肌醇、16 μmol/L叶酸)，置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3-4天半量换液1次。培养14天时收获造血细胞(收获细胞具体方法见参考文献[5])制成单个核细胞悬液，用甲基纤维素半固体集落培养法测定其集落形成能力，培养液为H4435 (其成分为IMDM中含1.0%甲基纤维素，30%胎牛血清，1% BSA, 10-4mol/L 2-巯基乙醇，2 mmol/L L-谷胺酰氨，50 ng/ml rhSCF, 20 ng/ml rhGM-CSF, 20 ng/ml rhIL-3, 20 ng/ml rhIL-6, 20 ng/ml rhG-CSF, 3 U/ml rhEPO)，置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，14天时计数粒单系集落形成单位(CFU-GM)、红系爆式集落形成单位(BFU-E)和混合集落形成单位(CFU-Mix)。

　　统计学处理

　　计量资料以均数±标准差表示，统计学分析采用SPSS 10.0软件包中单因素方差分析组间差异。

　　结果

　　人AGM区基质细胞的体外培养

　　第5代的hAGMS1-S5细胞在体外均生长迅速，呈贴壁生长。经4-5天细胞长满，其形态学表现主要为成纤维间质细胞样，少量呈内皮样，是早期胚胎AGM区来源的异质细胞群(图1)。

　　造血生长因子mRNA水平表达检测

　　RT-PCR检测结果显示,人AGM区基质细胞S1-S5均表达IL-6、SCF、Flt3-L和OSM等造血生长因子mRNA，不表达IL-3、TPO、M-CSF及LIF等细胞因子mRNA(图2)。

　　人AGM区基质细胞分泌造血生长因子水平检测

　　hAGMS1-S5细胞培养上清液中的IL-6、SCF和Flt3-L的分泌水平见表1，hAGMS1-S5组间比较各因子水平无显著性差异(P>0.05)。Table 1. Levels of factors IL-6, SCF and Flt3-L secreted by hAGMS1-S5 stromal cells (略)

　　脐血CD34+细胞与hAGMS1-S5饲养层细胞共培养后的集落形成能力

　　集落培养结果表明，hAGMS1-S5能维持CFU-GM、BFU-E 、CFU-Mix等各系集落形成，共培养后CFU-GM、BFU-E 、CFU-Mix均有不同程度的扩增，与无饲养层组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)，提示造血微环境来源的AGM区基质细胞能体外维持造血干/祖细胞的不被完全耗竭，并具有多系造血能力。hAGMS1-S5组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)，其中hAGMS3、S4组优于S1、S2、S5组，但hAGMS3、S4两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Table 2. Effect of hAGMS1-S5 cells on the expansion of hematopoietic colony formation cells (略)

　　讨论

　　哺乳动物胚胎期造血发生分为原始造血(primitive hematopoiesis)和永久造血(definitive hematopoiesis)两个过程。在原始造血过程中，位于胚外的卵黄囊产生有核红细胞及少量巨噬细胞，并提供早期胚胎生长发育所需的营养物质。随着胚胎的发育，原始造血被永久的多系造血所取代，永久造血的多潜能HSC具有自我更新和多向分化的能力。AGM区是多潜能HSC出现的最早区域，该区的微环境对永久造血的发生提供了必要的启始条件，阐明其作用机制对造血系统发生发育的基础研究及HSC工程研究都具有重要意义。AGM区基质细胞及其分泌的造血生长因子为HSC的产生提供了合适的造血微环境，具有重要的研究价值。迄今为止，已有两个研究小组建立了小鼠AGM区基质细胞系并证实其具有造血支持作用[6,7]。2005年本课题组首次从孕30-35天的人胚胎取材培养出5株人AGM区基质细胞(hAGMS1-S5)[4]，并证实hAGMS1-S5具有造血支持作用，对脐血长期培养启动细胞(long-term culture-initiating cell，LTC-IC)具有维持及适度的扩增作用[5]。造血生长因子是影响造血细胞增殖、分化的一群调控因子。Xu等[6]应用RT-PCR方法对小鼠AGM区基质细胞表达的造血生长因子进行了检测，结果显示小鼠AGM区基质细胞表达SCF、IL-6和OSM等mRNA,不表达G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-11、M-CSF、LIF、TPO等mRNA。有关人AGM区基质细胞表达造血生长因子的研究尚未见报道。本研究应用RT-PCR方法对我们所建立的5株人AGM区基质细胞表达的造血生长因子进行了检测，结果发现体外培养的人AGM区基质细胞表达SCF、Flt3-L、IL-6、OSM等造血生长因子mRNA，不表达IL-3、M-CSF、LIF 、TPO等因子mRNA，与小鼠AGM区基质细胞表达的造血生长因子相一致。此结果亦提示，作为永久HSC的最早产生部位，AGM区基质细胞表达的造血生长因子主要是作用于早期造血干/祖细胞的因子。为进一步明确这几种造血生长因子在蛋白质水平的表达，本研究应用ELISA方法检测了其在人AGM区基质细胞培养上清中的分泌水平，结果显示在hAGMS1-S5均可测得蛋白质水平的SCF、Flt3-L和IL-6等造血生长因子，不同株细胞分泌因子水平相当。SCF是c-kit的配体，它是作用于最早期造血干/祖细胞的造血细胞因子，其主要生物学活性为刺激最原始的HSC增殖并促进其向定向造血祖细胞分化生长。Flt3-L是酪氨酸激酶受体3的配体，与SCF有一定的同源性，其作用与SCF相类似，作用于早期造血干/祖细胞，与其他造血生长因子协同促进造血干/祖细胞的自我更新、增殖和分化。IL-6主要由活化的单核细胞产生，T细胞、B细胞、骨髓基质细胞和其他间质组织细胞也都能产生，主要作用于多潜能祖细胞，促进其增殖和分化。OSM除抑制肿瘤细胞生长外，还具有多种生理功能，是细胞生长与分化的重要调节因子[8,9]，对造血干/祖细胞的发生发育有重要调节作用。Mukouya-ma[8]等采用RT-PCR及原位杂交的方法均检测到孕11.5天小鼠胚胎的AGM区组织表达OSM mRNA，为进一步探讨OSM在AGM区造血发生中的作用，他们分离小鼠胚胎的AGM区组织进行体外培养，结果发现OSM不仅可促进AGM区的HSC扩增，还同时促进AGM区内皮样细胞的扩增，推测OSM可能是通过作用于造血细胞与内皮细胞的共同前体细胞-成血血管细胞而发挥作用的。本研究证实人AGM区基质细胞亦表达OSM mRNA，因目前无OSM ELISA试剂盒，未能对其在细胞培养上清中的分泌水平进行检测。近年来血管内皮发生与造血发生发育之间的关系日渐引人关注，本课题组对人AGM区基质细胞的基因表达谱进行分析亦发现其表达与血管内皮细胞发育有关的基因如TEK、HEY2[10]，为阐明AGM区血管发生与造血发生发育之间的关系提供了重要的线索。为进一步证实人AGM区基质细胞的造血支持作用，本研究将脐血CD34+细胞与hAGMS1-S5共培养后检测其造血集落形成能力，结果提示CFU-GM、BFU-E及较早期的造血集落CFU-Mix均有不同程度的扩增，这更进一步从功能上表明人AGM区基质细胞可促进及维持一定量的早期造血干/祖细胞的增殖。AGM区基质细胞可能通过与造血细胞的直接接触、分泌多种造血生长因子调节造血细胞的生长、发育、增殖及分化。5株人AGM区基质细胞S1-S5的造血支持作用组间比较亦显示有显著性差异，其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5。但RT-PCR及ELISA检测结果显示hAGMS1-S5细胞表达IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生长因子的种类及其分泌水平无显著性差异，因此AGM区基质细胞可能还通过分泌其他的调控因子发挥造血支持作用，值得进一步深入研

　　。

　　【参考文献】

　　1 Dzierzak E. Ontogenic emergence of definitive hematopoietic stem cells. Curr Opin Hematol, 2003; 10: 229-234

　　2 Cumano A, Ferraz JC, Klaine M, et al. Intraembryonic, but not yolk sac hematopoietic precursors, isolated before circulation, provide long-term multilineage reconstitution. Immunity, 2001; 15: 477-485

　　3 Tavian M, Robin C, Coulombel L, et al. The human embryo, but not its yolk sac, generates lympho-myeloid stem cells: mapping multipotent hematopoietic cell fate in intraembryonic mesoderm. Immunity, 2001; 15: 487-495

　　4 陈惠芹, 张绪超, 黄绍良等. 人AGM区基质细胞系的建立及其生物学特性. 中山大学学报•医学科学版, 2005; 26: 20-23

　　5 陈惠芹, 张绪超, 黄绍良等. 人AGM区基质细胞对脐血LTC-IC的支持作用. 中国实验血液学杂志, 2006;14：94-97

　　6 Xu MJ, Tsuji K, Ueda T, et al. Stimulation of mouse and human primitive hematopoiesis by murine embryonic aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cell lines. Blood,1998;92: 2032-2040

　　7 Oostendorp RA, Harvey KN, Kusadasi N, et al. Stromal cell lines from mouse aorta-gonads-mesonephros subregions are potent suppor-ters of hematopoietic stem cell activity. Blood, 2002; 99: 1183-1189

　　8 Mukouyama Y, Hara T, Xu M, et al. In vitro expansion of murine multipotential hematopoietic progenitors from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region. Immunity, 1998; 8:105-114

　　9 Miyajima A, Kinoshita T, Tanaka M, et al. Role of Oncostatin M in hematopoiesis and liver development. Cytokine Growth Factor Rev, 2000; 11:177-183

　　10 付劲蓉, 陈惠芹, 张绪超等. 人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析.中国实验血液学杂志，2006;14:726-730.