水蛭素融合蛋白研究进展

　　作者：张传领　　作者单位：军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

　　【摘要】水蛭素是一种高效特异的凝血酶抑制剂，临床上用于血栓病的预防和治疗，但它半衰期短、出血副作用强和功能单一。近年来，通过把水蛭素与某些功能蛋白融合表达来解决这些问题，得到的融合蛋白或在体内延长水蛭素的半衰期，或降低其出血副作用，或带来新的功能，如：溶栓、抑制血小板凝集、特异寻靶等。本文对近年来国内外水蛭素融合蛋白研究状况进行综述。

　　【关键词】 水蛭素,融合蛋白,抗凝 血栓形成

　　Abstract Natural hirudin extracted from the secretion of medical leech salivary gland is a singlechain peptide containing 65 aminoacid residues with molecular weight of 7000 D, and exists in three isomers of HV1, HV2 and HV3. Hirudin possesses three disulfide bridges forming the structure of core cyclic peptides, which binds to the catalytic site of thrombin so as to inhibit the catalysis of thrombin. Its cterminus rich in acidic aminoacid residues possesses hydrophilicity, and is free on the molecular surface, and can bind with fibrin recognition site of hirudin. The minimal segment of 12-16 Cterminal acidic residues keeps the minimal activity of antithrombosis. Thus, hirudin, as a potent and specific inhibitor of thrombin, can be used to protect from and to treat clinically thrombosis. As it has some disadvantages such as short halflife, bleeding sideeffect and monofunction, and so on, hirudin has been fused with some other functional proteins in recent years. The obtained fusion proteins can prolong the half life of hirudin, or relieve it bleeding side effect, or bring new functions, such as thrombolysis, inhibiting the platelet aggregation, targething specifically. The research progress in hirudin fusion protein was summarized in this review.

　　Key words hirudin; fusion protein;anticoagulation; thrombosis

　　J Exp Hematol 2007; 15(1):215-218

　　当今心血管疾病已成为危害人类健康的头号敌人，其中血栓的形成是引起心脑血管疾病的重要原因。水蛭素是近年来研制开发的新一代抗凝蛋白药物，被用于血栓病的预防和治疗，其效果明显优于肝素，而又无肝素诱导的血小板减少症[1]。但是水蛭素作为一种小分子蛋白药物，同样具有在体内代谢快，半衰期短的缺点,通过把水蛭素与辅助多肽融合表达，就可以使水蛭素在人体内缓慢释放，延长半衰期;水蛭素只有抗凝作用，而没有溶栓功能，通过与其他溶栓蛋白融合表达，就可以得到抗凝溶栓双功能蛋白药物， 将更有效的溶解血凝块并抑制新血栓的形成;水蛭素在体内有广泛的抑制凝血酶作用，当水蛭素的剂量大于抗凝所需的剂量时，就会发生明显的出血现象，通过与纤维蛋白特异抗体融合，就使得水蛭素在血栓部位富集，有效的发挥抗凝功能，从而避免全身的出血副作用。另外，水蛭素与其他抗凝成分结合，就会从多个途径阻断血栓的形成，更高效的起到抗栓效果。近年来，许多人将3种或以上的抗凝成分同时融合在一个分子中，且表明能够产生更为有效和更有针对性的化合物，这种嵌合分子代表了抗凝药物研制的一个新的方向。

　　长效缓释型水蛭素

　　水蛭素是一种多肽药物，当以游离形式进入体内后，被体内丰富的蛋白酶切割而失活;另外，水蛭素分子量只有7 000 kD左右，在体内会很快地被肾小球滤过，再经尿液排出[2]。若要水蛭素能够长效缓释，就要想法屏蔽掉水蛭素上蛋白酶敏感位点，或增大分子量，降低肾小球滤过率。围绕这个思路，有些科研人员做了许多有意义的尝试。

　　Wirsching等[3]对水蛭素蛋白酶敏感位点进行突变，筛选抗酶切的活性突变体，不过这种方法很难适应人体内众多的蛋白酶。Avgerinos等[4]通过PEG对蛋白酶敏感位点进行修饰，不但抑制蛋白水解酶的降解，而且增大蛋白分子量，降低肾小球通过率，使得药物半衰期得以延长，在临床上就可以降低使用剂量或减少注射频率。不过，PEG修饰蛋白的过程不易控制。Syed等[5]为了使水蛭素在保持高效抗凝活性的同时，延长血浆半衰期。他们大胆假设水蛭素与白蛋白基因融合能够达到这一目的，并设计了两个融合蛋白：HV3经C末端与白蛋白相连(HLA)和HV3经N末端与白蛋白相连(ALH)。实验证明，HLA不但保留着抑制凝血酶的性质，还保留兔血清白蛋白染料接合的特性。通过显色底物法分析，40 nmol/L的HV1与30 nmol/L的HLA具有相同的结果，这表明融合蛋白HLA对凝血酶有高亲和抑制能力。纯化后HLA注入兔子体内，代谢半衰期达到4.60±0.16天，而水蛭素的半衰期只有0.7小时。这些结果表明，利用基因融合的策略来延长抗凝蛋白的半衰期是可行的、有效的。

　　目前，临床常用的溶栓蛋白有葡激酶(SAK)、链激酶(SK)、尿激酶(UK)组织型纤溶酶原激活剂(tPA)。单纯使用这些溶栓药物容易发生溶栓后再栓塞，临床上采用给予溶栓药物的同时给予抗凝药物能有效地防止再栓塞的发生，这已经在许多动物实验中和100 000名患者身上得到验证[6，7]。为更充分发挥溶栓和抗凝药物的优势，将二者融合表达，就可以得到抗凝溶栓双功能蛋白药物，将更有效的溶解血凝块并抑制新血栓的形成。目前，有许多新型溶栓抗凝双功能融合蛋白药物正在研制开发中。

　　纤溶酶原激活剂葡激酶(SAK)是治疗心肌梗死的溶栓良药，它不但能够有效地溶解富含红细胞的凝血块，还能够有效溶解富含血小板的凝血块。但是SAK不能抑制凝血酶的活性，而这个性质能大大提高SAK的溶栓潜能。Szarka等[8]分别在SAK的C端和N端与水蛭素融合，SAK的纤溶酶原激活特性没有因为与水蛭素融合而改变。SAK表面呈高度不均衡的亲水性、疏水性，而N端的15个氨基酸游离在球体外，非常柔韧，在SAK与PLG(纤溶酶原)形成复合物时，SAK去掉N端的10个氨基酸。所以HV1SAK进入体内很快就被纤溶酶切开，游离为HVSAK(1-10 aa)和SAK(11-135 aa)。这样就无法体现融合蛋白的功能，HV1SAK也就毫无意义了，而SAKHV1比HV1SAK更能耐受纤溶酶的降解。可能是吸取以上研究的经验与教训，Lian等[9]通过一个coiledcoil序列将SAK和HV构建成一个Y形异源二聚体，从而保证了SAK和HV都具有游离的N末端而不影响各自的功能。该研究显示，融合蛋白不仅很好的保持了溶栓和抗凝活性，而且HV的C末端对凝血酶的亲和性还使融合蛋白对富含纤维蛋白的血栓具有一定的靶向性。

　　另外，本实验室成功地构建了tPA和HV的融合蛋白基因，并将其导入了毕赤酵母，获得了有活性的表达产物(TFXH)。在构建融合蛋白基因时将水蛭素置于tPA下游，主要基于以下考虑：在融合蛋白不被裂解的情况下，水蛭素N端被封闭，其抗凝活性丧失，可减少出血副作用的发生;同时利用融合蛋白中游离的水蛭素C端对凝血酶的高亲和力，增加TFXH对血栓的靶向性，提高溶栓效率。但在毕赤酵母中TFXH的表达量较低，虽经发酵条件的优化，但表达量未见显著提高，这成为了限制对其进行开发生产的严重障碍[10]。

　　靶向型水蛭素

　　高浓度的水蛭素能有效地抑制凝血酶，但伴随着常见的出血综合症。一个战略性的解决此问题的方法就是让水蛭素能够寻靶纤维蛋白，使水蛭素只在血栓部位发挥抗凝功能，从而避免全身出血的风险。Bode等[11]将纤维蛋白抗体与水蛭素通过化学的方法偶联起来。这个化学偶联物能够有效的抑制血块实验中纤维蛋白的沉积，同时在灵长类动物实验中表现出较强的抗栓效果[12]。不过，这种化学偶联物也有几个缺点，最主要的是产量过低和连接过程中水蛭素部分活性的损失。水蛭素需要自由的N端和C端才能有抗凝活性，直接地在水蛭素的一端连上单克隆抗体，将导致水蛭素活性的消失。为了解决这些问题，Peter等[13，14]通过重组的方法将Fxa识别序列引入到纤维蛋白单克隆抗体和HV之间，这样融合蛋白被单克隆抗体带到血栓的纤维蛋白处后，由此处富含的Fxa断开，释放HV的N自由端，在血栓部位发挥强抗凝活性，而不引起全身的出血现象。实验结果表明，该融合蛋白能在体外被FXa裂解并表现出抗凝活性，但进入体内后是否会产生靶向性的抗凝从而减少出血的可能，这一点还未得到证实。

　　多功能复合型水蛭素

　　近年来，为了寻求更好的抗凝溶栓效果，并尽可能的降低其副作用，科研人员不再单纯的围绕一两个抗凝溶栓分子做文章了，而是扩大视野范围，囊括了几乎所有的抗凝溶栓分子或与其有关的重要分子，并通过基因重组的方式将它们(或其重要的结构域)巧妙地连接起来，期望发挥它们的协同作用，或是产生新的功能。

　　Walda等[15]将抗血小板、抗凝血酶成分和SAK连成为融合蛋白PLATSAK(antipateletantithrombin SAK),SAK位于N端，与RGD序列(ArgGlyAsp)序列通过Fxa断裂位点连接，接着是纤维蛋白肽A(fibrinopeptide A)的8-16位残基，它的C端是水蛭素的54-65位残基。由于SAK的纤维蛋白特异性，PLATSAK可到达纤维蛋白块，也就是Fxa的富集环境，Fxa裂解PLATSAK，释放出抗血小板抗凝血酶成分，它包括3部分：一是RGD序列，它与纤维蛋白原受体(GpⅡb/Ⅲa)结合，抑制血小板聚集;二是纤维蛋白A片段，它能抑制凝血酶活性位点;三是C端的水蛭素片段，它能结合并阻断凝血酶的阴离子结合位点。体外实验中，PLATSAK可明显抑制凝血酶活性，并可以激活纤溶酶原，其纤溶能力与重组SAK几乎相同，但其抗血小板凝集能力并不显著，这可能是因为RGD序列被埋在融合蛋白分子内部的缘故。但在狒狒的动静脉的模型中，PLATSAK却可以使血小板的沉积，这也说明作者采用的这种融合策略是成功的[16]。Walda等[15]大胆地选用溶栓蛋白、抗凝蛋白、抗血小板三肽、纤维蛋白肽A作为新蛋白的素材，并且不是将几个完整的蛋白简单地拼结起来，而是选用蛋白的功能结构域，这样不但可以多引入几个功能，而且还不至于过分增大融合蛋白的分子量，增强融合蛋白的免疫原性。在功能域之间作者巧妙地将Fxa识别序列作为连接子，这样一方面避免两蛋白在空间上相互影响，另一方面使得融合蛋白特意地在血栓部位裂解开来，释放出活性。这个融合蛋白给我们两点启发：第一，在分析我们的研究对象时候，一定要抓住它的特性，并巧妙的利用它;第二，对现有的东西进行优势组合，可以创造出更高效的新发明。

　　融合蛋白最大的难点就是如何能保证各组分在融合之后仍然保持原来的活性。这与各组分的连接顺序和连接子的设置有很大关系，连接之后是否还需要在病灶部位断开，这些都是要仔细思考，精心设计的。做融合蛋白希望通过各组分优势组合达到效益的最大化，但是也会出现副作用集中放大的可能，所以要在药效和药物副作用之间选取一个平衡点，为了达到这个目的国内外许多学者做着类似的努力。像Bi等[17]同样设计两个多功能融合蛋白scuPA(32 k)linkerHir (residues 53-65) RGD和hirudin (residues 1-33)RGDSPhirudin(residues 34- 65)scuPA(32 k)。这两个融合蛋白不但有纤溶酶原激活能力，还有抑制血小板聚集和抗凝血酶的能力。在第一个融合蛋白中scuPA依然保持其生物学活性，它的纤维蛋白溶解能力和氨基溶解的能力要比第二个高，这可能是因为scuPA通过linker与hir相连，没有影响到scuPA的天然构象。据报道，水蛭素C端12肽的抗凝活性只有天然水蛭素的2%，所以第一个融合蛋白的抗凝活性比较低。由于这两个融合蛋白对纤维蛋白和血小板有亲和性，所以在体内能够直接定向血栓，这样就会降低出血的风险。同时，与凝血酶结合后，暴露出RGD序列，能够有效的预防再栓塞。但是，这两个融合蛋白在动物体内的情况还需要进一步的研究。Szemraj等[18]构建了具有溶栓、抗栓、抗血小板和纤维蛋白特异结合能力的多功能融合蛋白，包括：①葡激酶SAK; ②抑制血小板聚集的RGD序列;③tPA与纤维蛋白特异结合的K2结构域;④水蛭素(Hir)，组合起来就是：SAKRGDK2Hir，但其确切功能还有待进一步的验证。Zhang等[19]将一种血小板抑制剂，低分子量单链尿激酶和凝血酶抑制结构域融合在一起。研究发现，该融合蛋白对ADP引起的血小板聚集具有靶向抑制作用，同时还具有抗血栓的功能。

　　基于现有药物的二次创新，就要突破原有药物的专利束缚，只有受专利保护的新药才能在市场上有强劲的生命力。上海复旦大学宋后燕教授从水蛭素晶体结构分析发现，在32-35残基位置引入RGD(ArgGlyAsp)序列更为合理，得到的水蛭素衍生物具有更强大的抗血小板和抗凝活性。动物实验表明，RGDhirudin的有效剂量只有水蛭素的一半，但是该药依然没有解决水蛭素的强出血副作用的致命缺点，且其出血倾向比同剂量的水蛭素还要大一些。为此，作者巧妙地对水蛭素的结构进行改造，突破国外水蛭素的专利束缚，创造出了一个更高效的一类抗凝药物，堪称二次创新的成功典范。目前该药已进入临床试验阶段[20]。

　　在目前的抗凝新药研究领域，要开发出一个全新的抗凝新药是十分困难的，大家的研究热点大都集中在对现有药物的改造或是对其优势的组合上，强强联手，发挥更大的药物疗效，同时想方设法降低药物的毒副作用，一般很难同时兼顾这两点，只能在利与弊之间选取一个合适的平衡点。现有抗凝药物的抗凝效果都还比较理想，但是大都存在同样的致命缺点就是出血副作用强，目前几乎不存在一个无出血倾向的高效抗凝药物。因此，急需创造出一个安全型的抗凝新药。

　　研究展望

　　近年来的研究表明，许多抗凝、溶栓、寻靶成分具有互补和协同作用，利用融合蛋白技术将他们组合连接，产生的水蛭素融合蛋白可能较单一的或联合使用具有更好的复合活性，甚至产生新的活性。融合蛋白药物的出现解决了使用单一蛋白的缺点和问题。相信随着生物学，基因工程研究的不断深入，人们对蛋白质结构和功能，蛋白质分子间相互作用的认识进一步提高，融合蛋白技术的应用也愈来愈广泛。

　　【参考文献】

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