趋化因子MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2在慢性髓系白血病细胞中的表达

　　作者：王伟良,沈悌,惠玉荣,顾惜春,李蓉生　　作者单位：卫生部北京医院血液科，北京 100730

　　【摘要】本文旨在研究MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2在慢性髓系白血病细胞中的表达，同时观察P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶对MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2 mRNA表达的影响。在bcr/abl 融合基因阴性和阳性慢性髓系白血病细胞中，采用半定量RT-PCR方法检测MIP-1α、MCP-1、CCR-1、CCR-2 mRNA的表达水平。结果表明 MIP-1α mRNA和CCR-1 mRNA在bcr/abl融合基因阳性细胞中不表达，但在bcr/abl融合基因阴性细胞中表达，而MCP-1 mRNA和CCR-2 mRNA在bcr/abl融合基因阳性和阴性细胞中均不表达。当P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶被抑制后，MIP-1α和CCR-1的mRNA表达水平恢复至正常水平。结论： P210bcr/abl融合蛋白抑制慢性髓系白血病细胞中MIP-1α和CCR-1 mRNA的表达，但对MCP-1和CCR-2 mRNA的表达无影响。

　　【关键词】 慢性髓系白血病

　　Abstract This study was aimed to explore the expression of MIP-1α，MCP-1 and their receptors CCR-1，CCR-2 in bcr/abl fusion gene positive CML cells，and to study the effects of P210bcr/abl fusion protein tyrosine kinase on expression of MIP-1α，MCP-1 and their receptors CCR-1，CCR-2 mRNAs in chronic myeloid leukemia cells. The expression levels of MIP-1α，MCP-1 and their receptors CCR-1，CCR-2 mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR in bcr/abl negative cells，bcr/abl positive cells，and P210bcr/abl-Rb-C-Box positive cells. The results showed that MIP-1α and CCR-1 mRNAs were expressed in bcr/abl negative cells，but not in positive cells. Both MCP-1 and CCR-2 mRNA cannot be detected in both bcr/abl positive and negative cells. After inhibiting P210bcr/abl tyrosine kinase activity by Rb-C-Box，expressions of MIP-1α and CCR-1 mRNAs were restored to normal (similar to P210bcr/abl negative cells). It is concluded that P210bcr/abl fusion protein inhibits the expression of MIP-1α and CCR-1 in chronic myeloid leukemia cells，but does not inhibit MCP-1 and CCR-2 mRNA expressions in these leukemia cells.

　　Key words chronic myeloid leukemia; bcr/abl fusion gene; P210bcr/abl fusion protein; MIP-1α; CCR-1; MCP-1; CCR-2

　　慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)前驱细胞的黏附功能存在缺陷。我们以前的研究已经证实，CML的前驱细胞中L-选择蛋白mRNA表达水平降低，而且发现这种异常改变与P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶的活性有关 [1] 。另外的研究表明，β -整合蛋白的功能也存在着缺陷。最近的研究发现，细胞趋化因子巨噬细胞炎症蛋白1α (macrophage inflammatory protein 1 alpha，MIP-1α)可抑制正常造血干细胞的增殖，但对CML细胞则无抑制作用[2，3]，其机理尚不清楚。为了研究CML逃逸MIP-1α抑制的机理，我们采用半定量RT-PCR对MIP-1α及其受体CCR-1、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)及其受体CCR-2在CML细胞株及CML患者的表达进行了研究，并观察其与P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)活性变化的关系，现报道如下。

　　材料和方法

　　细胞系

　　小鼠CML细胞系32Dc13 于含有10%热灭活的胎牛血清(FBS)(Hyclone，CIT)和10% WEHI-3B条件介质(含有白细胞介素-3)的RPMI 1640(Gibco BRL)培养液中，在37℃、 5% CO2条件下培养。

　　32Dc13-bcr/abl细胞 含有人P210bcr/abl 融合蛋白cDNA，该细胞表达人P210bcr/abl融合蛋白。

　　K562细胞 作为P210bcr/abl 阳性对照。

　　U937细胞 作为P210bcr/abl阴性对照。

　　CML患者

　　5例CML均为初治患者(慢性期)。临床诊断标准符合张之南等主编的《血液病诊断及疗效标准》[4]。抽取骨髓液5-10 ml，肝素抗凝，计数细胞后提取总RNA。

　　RNA分离

　　采用RNA简易分离试剂盒( Qiagen，Cat No.74104)分离提纯总RNA。方法参照参考文献[1]。

　　cDNA合成

　　应用Super ScriptTM First Strand cDNA System for First Strand cDNA Systhesis Kit (Gibco BRL，IV18089-011) 合成cDNA，方法参照参考文献[1]。

　　RT-PCR引物合成

　　设计合成基因特异性的引物，以避免靶基因的交叉反应。G3PDH (Clontech) 作为内对照。引物序列如下：

　　G3PDH 正义链 5′- TGAAGGTCGGTGTGAACGG-GTTTGGC-3′，反义链 5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′，扩增983 bp片段; P210bcr/abl 正义链 5′- ACAGAATTCGCTGACCATCAATAAG-3′，反义链5′-GTTGACTGGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3′，扩增385 bp片段;MIP-1 α正义链 5′-GAAGAGTCCCTCGATGTGGTA-3′，反义链 5′-CCCTTTTCTGTTCTGCTGACAAG-3′，扩增561 bp片段; CCR-1 正义链5′- GACTATGGGGACTCCACTCCA-3′，反义链5′- AGTGAACTCCCACTGGGCCTT-3′，扩增500 bp片段;MCP-1 正义链 5′-GGAAAAATGGATCCACACCTTGC -3′，反义链 5′-TCTCTTCCTCCACCACCATGCAG -3′，扩增582 bp片段; CCR-2 正义链5′- GTTACCTCAGTTCATCCACGGC-3′，反义链5′- TGGTAGA-GAGGCAAACACAGCC-3′，扩增530 bp片段。

　　转染

　　应用电击方法(BTX电击仪，BTX Inc)将Rb-C-Box基因转染入32Dc13-bcr/abl细胞和32Dc13细胞。方法参照参考文献[1]。为了测试Rb-C-Box转染细胞中Rb-C-Box的表达水平，应用RT-PCR测定其mRNA的含量。引物为：正义链 5′- TTGCATGCCTGCAGGTCGTTAC-3′和反义链5′- GACTTGGAAATCCCCGTGAGTC-3′。非转染细胞作为对照，生长于10% FBS和10% WEHI-3B条件介质的培养液中。

　　半定量RT-PCR

　　所有的PCR反应均在GeneAmp PCR System 2400仪(Perkin Elmer)上进行。应用PCR简易快速试剂盒(Pharmacia-Biotech)进行RT-PCR反应。整个反应体积为25 μl，加入cDNA体积均为2 μl。操作根据试剂盒的说明书。为了比较不同标本的PCR产物，所加入的cDNA量、dNTPS量、缓冲液和Taq多聚酶数量均是相同的。总的PCR循环是28个。G3PDH作为内对照。所有PCR产物经过2%琼脂胶，EB染色，标准分子量是100 bp，采用Eagle Eye II System (Stratagene)摄像。

　　结果

　　细胞中bcr/abl融合基因的表达

　　在32Dc13-bcr/abl细胞、转染Rb-C-Box基因的32Dc13-bcr/abl细胞和K562细胞内，bcr/abl mRNA表达均呈阳性，但在前两种细胞中bcr/abl mRNA的表达强度差异无显著性。在32Dc13细胞和U937细胞中未测到bcr/abl mRNA(图1)。5例CML患者骨髓细胞均表达bcr/abl mRNA。

　　bcr/abl对MIP-1 、MCP-1和CCR-1 、CCR-2 mRNA表达的影响

　　MIP-1α mRNA和CCR-1 mRNA表达于bcr/abl融合基因阴性细胞，在阳性细胞中均不能测到 (图2A和2B)。bcr/abl融合基因阴性和阳性细胞均不表达MCP-1和CCR-2的mRNA(图3A和3B)。5例CML患者骨髓细胞均不能测到 MIP-1α、MCP-1、CCR-1和CCR-2 mRNA。

　　P210bcr/abl酪氨酸激酶抑制剂Rb-C-Box对P210bcr/abl阳性细胞中MIP-1 和CCR-1 mRNA表达作用

　　转染细胞中Rb-C-Box mRNA高表达，而非转染细胞则为阴性，证实Rb-C-Box 基因转染成功。P210bcr/abl和Rb-C-Box双阳性细胞中MIP-1α和CCR-1 mRNA的表达水平与P210bcr/abl阴性细胞相同(图2)，而MCP-1和CCR-2 mRNA 表达水平仍然无变化(图3)。

　　人类白血病细胞中MIP-1α、MCP-1、CCR-1和CCR-2 mRNA的表达

　　首先在4种人类白血病细胞株中测定了MIP-1α、MCP-1、CCR-1和CCR-2 mRNA的表达。这4种人类白血病细胞株包括： HL-60、U937、K562和BV137(人类CML细胞株，bcr/abl基因阳性)。结果显示: 在两种人类bcr/abl基因阳性CML细胞株(K562和BV137)中，MIP-1α、MCP-1、CCR-1和CCR-2 mRNA均未测到，而在另两种人类非CML细胞株(HL-60和U937，bcr/abl基因均阴性)中，均表达上述4种mRNA(图4)。然后对5例CML患者的骨髓细胞测定MIP-1α、MCP-1、CCR-1和CCR-2 mRNA表达，结果均显示阴性(注：在测定人类白血病细胞中，MIP-1α引物改为： 正义链 5′-CTTGCTGCTGACACGCCG-ACCGCCTGC-3′，反义链 5′-GTCGAGGTGCAGCGA-CGACTGTATAAA-3′，扩增197 bp片段; 其余引物无变化)。

　　讨论

　　细胞趋化因子在调节正常造血过程中起重要作用。MIP-1α和MCP-1均属于细胞趋化因子家族的C-C组。MIP-1α在体内作为一种主要的造血负调控因子，对正常的造血干/祖细胞的自身复制和增殖分化均具有直接的抑制作用;另外，MIP-1α对处于比较成熟的髓系定向祖细胞具有促分化(成熟)作用。MIP-1α通过与靶细胞上的受体CCR-1结合而发挥作用[5，6]。所有细胞因子受体(包括CCR-1和CCR-2)均属于含有7个跨膜区域的G-蛋白受体家族。体外研究发现，MIP-1α对CML前驱细胞无任何作用，其机理不清楚，Wark等[7]认为: ① P210bcr/abl融合蛋白中蛋白酪氨酸激酶干扰MIP-1α受体的表达;②干扰MIP-1α与CCR-1结合后的细胞内信号传递。

　　我们的研究发现，bcr/abl基因阳性和阴性细胞均能表达MIP-1α mRNA，但阴性细胞表达水平明显高于阳性细胞，而CCR-1 mRNA仅表达于阴性细胞。当P210bcr/abl蛋白中的酪氨酸激酶被C-Box抑制后，bcr/abl基因阳性细胞表达MIP-1α mRNA和CCR-1 mRNA的水平恢复至bcr/abl基因阴性细胞。这提示CML细胞逃脱MIP-1α的抑制作用可能与P210bcr/abl融合蛋白的表达有关，后者的表达直接或间接抑制MIP-1α和CCR-1的表达。

　　MCP-1除具有趋化单核细胞移动功能外，也参与血细胞的调节。在LTC体系中加入MCP-1，正常造血干/祖细胞的增殖和分化被抑制，但MCP-1对CML作用的报道较少。我们采用半定量RT-PCR，在bcr/abl基因阳性和阴性细胞中测定了MCP-1及其受体CCR-2的mRNA表达水平，结果发现bcr/abl阳性和阴性CML细胞均不表达MCP-1和CCR-2 mRNA，这是否提示MCP-1对CML细胞无作用，尚需进一步研究。

　　另外，我们对5例CML患者的测定结果也与在小鼠CML细胞系中的测定结果相同。这些结果提示P210bcr/abl融合蛋白抑制CML细胞中MIP-1α及其受体CCR-2的mRNA表达，但对MCP-1及其受体CCR-2的mRNA表达无影响。

　　【参考文献】

　　1王伟良，沈悌，惠玉荣等. bcr/abl融合基因对β1整合素和L-选择素基因表达的影响. 中华血液学杂志，2003; 24：337-339

　　2Nicholls SE，Lucas G，Graham GJ，et al. Macrophage-inflammatory protein-1alpha receptor expression on normal and chronic myeloid leukemia CD34+ cells. J Immunol，1999;162:6191-6199

　　3Durig J，Testa NG，Lord BI，et al. Characterisation of the differential response of normal and CML haemopoietic progenitor cells to macrophage inflammatory protein-1alpha. Leukemia，1999; 13:2012-2022

　　4陆道培，童春荣. 慢性粒细胞白血病.见：张之南、沈悌主编.《血液病诊断及疗效标准》. 第二版，北京：科学出版社，1998:219-227

　　5Su S，Mukaida N，Wang J，et al. Inhibition of immature erythroid progenitor cell proliferation by macrophage inflammatory protein-1alpha by interacting mainly with a C-C chemokine receptor，CCR1. Blood，1997; 90:605-611

　　6Ramaraj P，Singh H，Niu N，et al. Effect of mutational inactivation of tyrosine kinase activity on BCR/ABL-induced abnormalities in cell growth and adhesion in human hematopoietic progenitors. Cancer Res，2004; 64:5322- 5331

　　7Wark G，Heyworth CM，Spooncer E，et al. Abl protein kinase abrogates the response of multipotent haemopoietic cells to the growth inhibitor macrophage inflammatory protein-1 alpha. Oncogene，1998; 16:1319-1324