血浆纤维蛋白原β148C/T基因多态性研究

　　作者：张焕铃 王俊霞 尤红煜 郑龙 刘福英 作者单位：河北医科大学实验动物学部分子生物学研究室，河北 石家庄 050017

　　【摘要】 目的 对河北省脑血管患者纤维蛋白原β148C/T基因多态性进行初步研究。方法 用聚合酶链式反应(PCR)，限制性片段长度多态性(RFLP)方法研究河北省77例心脑血管患者纤维蛋白原β148C/T基因多态性。结果 脑血管患者纤维蛋白原β148基因频率C=0.364,T=0.636，与广东汉族健康人基因频率(C=0.715、T=0.285)比较差异显著(P<0.05)。结论 纤维蛋白原β148C/T突变基因T与纤维蛋白原水平、严重的颈动脉粥样硬化明显相关。

　　【关键词】 纤维蛋白原,基因,基因多态性,基因型

　　人纤维蛋白原(fibrinogen,Fg) 即凝血因子Ⅰ，是由肝细胞合成、分泌的一种糖基化蛋白，平均分子量340 kD。最近，许多前瞻性研究显示，动脉硬化血栓并发症病人血浆Fg功能明显增强，认为Fg功能增强对冠心病和脑梗死的发生更具有危险性〔1，2〕。Fg基因多态性与血浆Fg水平升高及与动脉硬化血栓并发症相关性研究也是近年来倍受关注的领域。杨志刚等〔3〕对广东健康人Fgβ148C/T、455G/A、448G/A基因多态性频率分布进行研究，发现广东健康人等位基因A455、T148和A448的频率均较欧洲一些国家的报道略高〔4，5〕。为了研究健康人与脑血管病人血浆的Fg基因多态性频率的分布情况，本文对河北省脑血管病人的血浆Fg水平及Fgβ148C/T的基因多态性进行了分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂 血浆纤维蛋白原Clauss测定法试剂盒购自上海医科大学华山医院技协生物试剂公司上海鹰跃试剂厂。引物：上游引物5′CCTAACTTCCCATCATTTTGTC3′，下游引物5′ATGGTTTTAAGTTTGTGGAAGC3′，由北京博润汇力基因技术有限公司(合成)。PCR扩增试剂盒及UNIQ10 柱式DNA胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。HindⅢ酶切试剂盒为Promega产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本采集 取早晨空腹肘静脉血，分别用3.8%枸橼酸钠及2%二胺四乙酸(EDTA)抗凝。枸橼酸钠试管取2.7 ml血，用Clauss测定试剂盒检测纤维蛋白原浓度;2 ml血以2% EDTA抗凝，用于基因组DNA提取。

　　1.2.2 基因组DNA的抽提 取EDTA抗凝血，采用改良盐析法提取基因组DNA。

　　1.2.3 PCR扩增 扩增体系为：10×PCR buffer 2.5 μl、25 mmol/L MgCl2 2 μl、2 mmol/L dNTP 1 μl、10 pmol/μl引物各1 μl、模板DNA 1 μl、1 U/μl Taq DNA聚合酶1 μl，加灭菌双蒸水至溶液体积为25 μl，混匀后以石蜡油50 μl覆盖。PCR反应过程包括35个循环，每个循环包括94℃45 s，58℃45 s，72℃45 s，最后一次循环后于72℃ 5 min ，首次循环前于94℃ 2 min,反应完成后置4℃过夜。2%琼脂糖凝胶电泳,1×TAE 缓冲液中电泳35 min后,紫外检测仪观察。切取300 bp左右条带，用于回收。

　　1.2.4 DNA回收 采用UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒,回收DNA，-20℃保存备用。

　　1.2.5 Fg β148C/T基因多态性分析 取回收DNA 10 μl，加入BSA 0.2 μl、Buffer 2 μl、10 U/μl HindⅢ 1 μl，dd H2O 6.8 ml,37℃孵育3 h，3%琼脂糖凝胶电泳30 min后,紫外检测仪分析电泳结果。Fg β148位点突变纯合子(T/T基因型)缺乏HindⅢ酶切位点,酶切后仅见与PCR扩增产物一样的300 bp片段,野生型(C/C基因型)酶切后可见202 bp和98 bp两个片段,突变杂合子(C/T基因型)酶切后可见300、202及98 bp 3个片段。

　　1.3 统计学处理 统计各基因型人数，用基因计数法计算等位基因频率;比较各基因型的血浆Fg水平，两组间均数比较用t检验。

　　2 结果

　　2.1 PCR扩增 PCR扩增产物电泳后可见77个样品都在300 bp左右有一清晰条带，结果见图1。

　　A、B、E:C/T基因型;C:C/C基因型;D:T/T基因型;F:100 bpLadder;下图同

　　图1 DNA扩增产物(略)

　　2.2 HindⅢ酶切 回收PCR扩增产物，用内切酶HindⅢ酶切结果见图2。

　　图2 Fgβ148C/T基因多态性(略)

　　2.3 基因频率及血浆Fg测定 将脑血管患者血浆Fg水平与Fg β148多态性频率进行统计学分析。C/C型病例共有4例，基因型频率为0.052;C/T型48例，基因型频率为0.623;T/T型25例，基因型频率为0.325。用基因计数法计算等位基因频率C=0.364，T=0.636。与广东汉族健康人基因频率〔3〕(C=0.715、T=0.285)两两比较差异显著(P<0.05)。另外Fg水平T/T型患者〔(4.13±1.44) g/L〕与C/T型〔(3.3±1.05) g/L〕、C/C型〔(3.62±0.38) g/L〕两两比较差异均显著。

　　3 讨论

　　流行病学研究证实，血浆Fg升高是血栓形成的危险因素。近年来又有许多学者认为血浆Fg可作为心脑血管疾病的危险因素〔6～8〕。Fg β基因多态性单独或与环境因素作用使循环中的Fg水平升高，造成或加速了动脉粥样硬化。Schmidt等〔4〕调查没有神经系统疾病史且神经系统检查正常的中欧白种人，结果发现T/T基因型和纤维蛋白原水平是颈动脉粥样硬化独立的危险因素。T/T基因型与严重的颈动脉粥样硬化密切相关，纯合子T/T基因型增加颈动脉粥样硬化的风险OR=6.17，远远超过了C/C或C/T型，推测认为：一种短暂的不依赖Fg水平的Fg启动基因，重复着固有的、非固有的刺激，在颈动脉粥样硬化病因学上起一定作用。杨志刚等〔3〕调查了广东汉族健康人Fgβ455G/A、148C/T和448G/A的基因多态性，结果等位基因A455、T148和A448的频率均较欧洲一些国家的报道略高〔4，5〕。本研究中河北省已确诊的77例脑血管病人Fgβ148的T148基因频率比广东健康人群显著升高，同时T/T型、C/T型病人Fg水平比C/C型也显著升高，说明脑血管疾病的发生在一定程度上与病人本身的基因型有关。由于广东汉族健康人Fgβ148C/T的基因多态性与欧洲一些国家报道的结果也存在一定差异，所以也不能排除河北省与广东省人群之间的地区差别。另外还有一种原因可能是由于人类长期饮食结构的不同，造成基因突变导致T的基因频率相对增高，从而增加了动脉粥样硬化及其他心脑血管疾病的发生几率。此结果同时也说明了Fgβ148C/T基因多态性与颈动脉粥样硬化有一定的相关性。

　　本文中A、B、E都属于C/T基因型，但A中300 bp和202 bp片段亮度相似，而B和E中却存在着差别，分析可能是由于病人本身基因组DNA中就存在两种基因型或者由于某种外在原因导致病人本身的基因型发生突变，而实验中所提取到的DNA恰是处于突变中期的，因此会存在两种基因型，酶切就会出现三条片段的亮度不均衡现象，此现象仍需进一步研究。

　　【参考文献】

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　　3 杨志刚,李风芹,刘国勋，等.纤维蛋白原β455G/A、 148C/T、 448G/A 基因多态性与血浆纤维蛋白原水平的关系〔J〕.中华血液学杂志,2000;9(21):4635.

　　4 Schmidt H,Schmidt R,Niederkorn K,et al.Betafibrinogen gene polymorphism(C148→T)is associated with carotid atherosclerosis:results of the Austrian Stroke Prevention Study〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1998;18:48792.

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