抑制Ras 信号通路可减弱小鼠胚胎干细胞的造血分化

　　作者：王晓燕　刘兵　,要晖宇　侯宁　,杨晓　　　作者单位：军事医学科学院基础医学研究所, 北京 100850; 1军事医学科学院生物工程研究所, 北京 100071

　　【摘要】为了探讨Ras信号通路对小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem cells, ES cells)造血分化的影响，将突变型基因RasN17转染小鼠ES细胞，免疫印迹检测RasN17的表达对Erk1/2及Akt磷酸化的作用，应用半定量RTPCR检测ES细胞在分化过程中与造血相关的基因的表达。结果表明：Ras N17的表达能抑制Erk1/2和Akt的磷酸化，携带RasN17基因的ES细胞在分化过程中Runx1 、SCL 及betamajor珠蛋白等基因的表达被显著抑制， 而FLK1的表达不受影响。结论：ES细胞体外造血分化需要Ras通路的活化。

　　【关键词】 胚胎干细胞,造血分化,Ras

　　Abstract To investigate the possible involvement of Ras signaling in the hematopoietic differentiation of embryonic stem cells (ES cells), ES cells were transfected with RasN17, the dominantnegative mutant of Ras. Western blot was used to test the effect of RasN17 expression on Erk1/2 and Akt phosphorylation, semiquantitative RTPCR was used to detect expression of gene related to hemalopoiesis in differentiation of ES cells. The results showed that the expression of RasN17 in the ES cells remarkably downregulated the phosphorylation of Erk1/2 and Akt simultaneously. Moreover, the expression of several markers related with hematopoiesis including Runx1, SCL and betamajor globin， were significantly suppressed in the EB expressing RasN17, whereas the transcription of Flk1, a gene required earlier than SCL in development of hematopoietic and endothelial lineages, was not influenced. It is concluded that the activation of Ras is pivotal for in vitro hematopoietic differentiation of ES cells.

　　Key words embryonic stem cell; hematopoiesis differentiation; Ras

　　J Exp Hematol 2007; 15(2):328-331

　　Ras是由1条多肽链组成的低分子量蛋白，由原癌基因ras编码而命名，包括K，N，H 3种类型。Ras的活性取决于其与GTP及GDP的结合，与前者的结合是其活化形式。 它是MAPK(Erk1/2)及PI3K等信号通路上游的重要组成成分，并通过参与调控这些信号通路而影响细胞的增殖与分化。最近研究发现，Ras及其下游信号分子均参与调控小鼠的胚胎发育，并且不同类型的Ras对胚胎发育特别是造血发育发挥不同的调控作用[1]。胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)是一种具有全能分化特性的细胞，其体外造血分化可以模拟并重现体内胚胎造血过程。报道表明：Ras及其下游的信号通路对ES细胞体外培养过程中全能性的维持非常重要[2]。但Ras蛋白能否调控小鼠ES细胞体外造血分化并不明确。为此，本研究探讨了Ras信号通路阻断对ES细胞造血分化的影响。

　　材料和方法

　　材料

　　DMEM、IMDM、胎牛血清、L谷氨酰胺、非必需氨基酸、胰蛋白酶均为Hyclone公司产品。硫代甘油(MTG)为Sigma公司产品。丙酮酸钠、无蛋白杂交瘤培养液Ⅱ(PFHM Ⅱ)购自GibcoBRL公司。小鼠白血病抑制因子(mLIF)购自Chemicon公司。小鼠干细胞因子(SCF)为PeprotTech公司产品。小鼠将CCE细胞接种于Co60照射后的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，于5% CO2、饱和湿度、37℃条件下进行维持培养。维持培养体系组成为：DMEM 含15%胎牛血清、2 mmol/L L谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 μmol/L MTG 及mLIF 1 000 U/ml。在造血分化培养前48小时将细胞传代于预分化培养体系，即将维持培养体系内DMEM更换为IMDM，其他成分不变。预分化培养48小时后按常规传代收集细胞并计数，细胞按2×103接种于直径35 mm的Petri dish，培养体系为：IMDM含15%胎牛血清、0.9%的甲基纤维素、2 mmol/L L谷氨酰胺、150 μmol/L MTG、1 mmol/L的丙酮酸钠、2 mmol/L PFHMⅡ、50 ng/ml的SCF，培养条件同维持培养。

　　ES细胞的pCMVRasN17及 pCMV质粒转染

　　质粒pCMVRasN17购自Clontech公司，pCMV质粒空载体为本室构建并鉴定。传代贴壁培养12小时的ES细胞应用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司产品)按说明书进行转染。24小时后传代于含neo基因的MEF(neoMEF)之上，并同时加800 μg/ml的G418筛选阳性克隆。 7 天后挑取不同细胞克隆扩增后鉴定外源基因的表达。

　　相关基因的RTPCR检测

　　TRIzoL(Sigma公司产品)提取细胞总RNA，按AMV及Ex Taq试剂盒 (TaKaRa)说明书进行半定量RTPCR以检测相关基因的表达，即每份样本分别取0.02 μg(0.01×)，0.2 μg(0.1×)，2 μg(1×)RNA进行逆转录反应，然后取1 μl的cDNA进行30循环的PCR。引物序列、退火温度及所扩增基因片段长度见附表。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统扫描电泳条带。

　　Western blot

　　ES细胞用0.25%胰蛋白酶消化后离心洗涤，应用维持培养体系贴壁再培养45分钟后收集悬浮细胞并用PBS洗涤; EB按上述分化方法培养并收集。以上样品加入细胞裂解液(BioRad)置冰上反复吹打裂解，煮沸5-10分钟，10 000×g，4℃离心10分钟，取上清，应用Pierce公司试剂盒(BCATM Protein Assay Kit)测蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂牛奶，0.1% tween20的TBS(TBST)封闭1小时， 用TBST洗膜，5分钟，共3次。之后分别按说明书用一抗、二抗(Cell Signaling)孵育带有目的蛋白的硝酸纤维素膜。按检测试剂盒(Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce)说明书检测目的蛋白。

　　结 果

　　ES细胞分化过程中Ras下游的MAPK和PI3K通路发生活化

　　收取ES细胞及分化不同时间的EB进行Western blot的检测，结果如图1所示。ES细胞内MAPK通路的Erk1/2及PI3K下游的Akt处于高水平磷酸化状态，可能是由于维持培养过程中加入的LIF可以激活这两条通路所致[3]。而分化第6天的EB内Erk1/2及Akt的磷酸化水平同前一时间点相比有显著升高。与此相对应，永久造血分化在第6天时发生。以上结果提示，作为上游信号的Ras可能通过活化这两条通路参与调控ES细胞的造血分化。

　　Figure 1. Activation of Erk1/2 and Akt during EB differentiation. ES and EB cells harvested at the indicated time points were subjected to Western blot.

　　RasN17在ES细胞内的表达下调MAPK(Erk1/2)及Akt的磷酸化水平

　　RasN17属于HRas，其第17位的Ser被突变成Asp，它的表达可使细胞内源性Ras失活，从而阻断Ras参与的信号通路的活化，起到与基因敲除类似的效应。应用Lipofectamine2000将质粒pCMVRasN17及pCMV转染CCE，经G418筛选后Neo基因的表达及Ras蛋白表达量的上调标志转染成功(图2A、 B)。Nanog和Oct4的表达是ES细胞处于未分化状态的两个重要标志，这两个基因的表达说明RasN17不影响ES细胞的维持培养(图2A)。ES细胞的克隆形态也不受RasN17的影响(图3A，D，G)，ALP是ES细胞处于未分化状态的另外一个标志，它的表达同样说明RasN17不影响ES细胞的维持培养(图3B，E，H)。如图2B所示，转染RasN17后ES细胞内Erk1/2 及Akt的磷酸化水平同时降低，说明其能够同时抑制MAPK及PI3K两条通路的活化。

　　RasN17表达下调ES细胞分化过程中造血相关基因的表达水平

　　提取分化7天的EB细胞总RNA进行半定量RTPCR，结果显示：转染RasN17的ES细胞在形成的EB的分化过程中，Runx1、scl基因、betamajor珠蛋白的表达下调(图4)， 而Flk1的表达没有明显变化。可见，RasN17可以下调ES细胞造血分化过程中某些相关转录因子及分化标记的表达，提示Ras通路的活化为ES细胞正常造血分化所必需。

　　讨 论

　　Ras下游信号通路包括MAPK(Erk1/2)及PI3K通路等。Ras活化后可以通过激活其下游不同的信号通路来调节ES细胞自我更新与分化[2]。Erk1/2的活化促进小鼠ES细胞的分化并且是ES细胞分化所必需的[2]，当Erk1/2的活化被阻断后，小鼠ES细胞在体外分化过程中不能形成中胚层及胚外内胚层，则ES细胞不能形成正常的EB[4,5]。PI3K通路的活化不仅为ES细胞体外培养过程中全能性的维持所必需[3]，同时也是ES细胞正常分化所必需的。例如， bFGF激活的PI3K通路参与ES细胞向EB分化过程中中胚层的形成[6]。此外，PI3K通路的活化参与调控小鼠胚胎发育过程中的永久造血分化，当将该通路上游的p85α基因敲除后，小鼠胎肝红系造血发生缺陷[7]。由此可见，Ras可通过调控多条信号通路来影响ES细胞体外正常分化及小鼠胚胎的正常发育。

　　ES细胞体外可以分化产生各系造血细胞，其造血分化过程可以模拟并重现小鼠胚胎造血发育。ES细胞造血分化过程伴随诸多造血相关转录因子及蛋白的表达，这些因子的表达既可作为造血分化的标志同时又是正常造血分化所必需的。其中，Runx1是一种与DNA结合的转录因子，其表达是小鼠胚胎造血发育过程中永久造血开始的标志之一。runx1-/-小鼠胚胎的永久造血缺失[8];runx1基因的丢失同样可以阻断ES细胞体外分化过程中永久造血细胞的产生[8,9]。scl(stem cell leukemia)基因在小鼠胚胎发育过程中为中胚层向造血细胞分化所必需。该基因缺失可导致胚胎由于造血分化异常而死亡，scl 基因缺失后ES细胞不能进行造血分化[10]。betamajor 珠蛋白是永久红细胞的标志。Flk1是VEGF的受体之一，在小鼠胚胎发育早期的中胚层细胞开始表达，其缺失导致胚胎发育过程中卵黄囊血岛不能形成，同时血管系统的发育出现异常[11]。我们的结果显示，RasN17可以下调ES细胞造血分化过程中Runx1、 scl及betamajor珠蛋白的表达，这表明Ras通路的活化是ES细胞造血分化所必需的。

　　与以往报道RasN17只阻断Erk1/2通路[5]不同，本研究中转染RasN17的ES细胞内Erk1/2及Akt磷酸化水平同时降低的结果表明：RasN17可能通过同时阻断MAPK(Erk1/2)和PI3K两条通路的活化影响ES细胞的造血分化。

　　本研究中，RasN17可能通过以下机制下调EB细胞内造血标志的表达：第一，使ES细胞不能形成正常的EB，则造血分化缺乏合适的微环境而发生缺陷;第二，MAPK(Erk1/2)和Akt信号通路的抑制直接影响造血细胞的产生;第三，以上两种机制同时存在。然而，RasN17抑制ES细胞造血分化的具体机制有待进一步明确。

　　【参考文献】

　　1Johnson L, Greenbaum D, Cichowski K, et al. Kras is an essential gene in the mouse with partial functional overlap with Nras. Genes Dev, 1997;11:2468-2481

　　2王晓燕，刘兵，毛宁. 小鼠胚胎干细胞自我更新的信号调控机制. 中国实验血液学杂志, 2006;14:1248-1252

　　3Paling NR, Wheadon H, Bone HK, et al. Regulation of embryo nic stem cell selfrenewal by phosphoinostide 3kinase dependent signaling. J Biol Chem, 2004; 279: 48063-48070

　　4Yao Y, Li W, Wu J, et al. Extracellular signalregulated kinase 2 is necessary for mesoderm differentiation. Proc Nati Acad Sci USA, 2003;100: 12759-12764

　　5YoshidaKoide U, Matsuda T, Saikawa K, et al. Involvement of Ras in extraembryonic endoderm differentiaion of embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 2004;313:475-481

　　6Chen Y, Li X, Eswarakumar VP, et al. Fibroblast growth factor (FGF) signaling through PI 3kinase and Akt/PKB is required for embryoid body differentiation. Oncogene, 2000; 19:3750-3756

　　7Huddleston H, Tan B, Yang FC, et al. Functional p85α gene is required for normal murine fetal liver erythropoiesis. Blood, 2003;102:142-145

　　8Okuda T, vanDeursen J, Hiebert SW, et al. AML1, the target of multiple chromosomal translocations in human leukemia, is essential for normal fetal liver hematopoiesis. Cell, 1996; 84:321-330

　　9Wang Q, Stacy T, Binder M, et al. Disruption of cbfa2 gene causes necrosis and hemorrhaging in the central nervous system and blocks definitive hematopoiesis. Proc Nati Acad Sci USA, 1996; 93: 3444-3449

　　10Endoh M, Ogawa M, Orkin S, et al. Scl/tal dependent process determines a competence to select the definitive hematopoietic lineage prior to endothelial differentiation. EMBO J, 2002; 21: 6700-6708

　　11Shalaby F, Rossant J, Yamaguchi TP, et al. Failure of bloodisland formation and vasculogenesis in Flk1deficient mice. Nature, 1995; 376(6535): 62-66