免疫分型在一些特殊类型急性白血病诊断中的应用

　　作者：宣恒报,李玉峰,曹维克,邓之奎,李元媛　　作者单位：南京医科大学附属淮安第一医院 中心实验室，江苏 淮安 223300

　　【摘要】目的 报告免疫分型在一些特殊类型急性白血病(AL)诊断中应用的重意义。方法 应用流式细胞术(FCM)分析369例AL的免疫表型。结果 369例AL中有2例诊断为急性髓细胞白血病(AML) M0，1例诊断为AML M7，1例诊断为急性杂合性白血病(HAL)，5例诊断为急性未分化型白血病(AUL)，2例诊断为侵袭性NK细胞白血病。结论 AML M0、AML M7、HAL、AUL和侵袭性NK细胞白血病等特殊类型AL的诊断依赖于细胞免疫表型分析。

　　【关键词】 白血病,诊断,免疫分型,流式细胞术

　　Abstract:Objective To report the important siganificance of the immunophenotype in the diagnoses of some special acute leukemias.Method The immunophenotypes of 369 acute leukemias were analyzed by flowcytometry (FCM).Results Among these acute leukemias final diagnoses of 2 acute myelogenous leukemia M0(AML M0) subtype,1 acute myelogenous leukemia M7(AML M7) subtype,2 hybrid acute leukemias (HAL),5 acute undifferentiated leukemias (AUL) and 2 aggressive natural killer cell leukemias were made.Conclusion The diagnoses of some special acute leukemias such as AML M0,AML M7,HAL,AUL and aggressive natural killer cell leukemias depend on their immunophenotypes.

　　Key words:leukemia;diagnosis;immunophenotype;flowcytometry

　　细胞免疫表型分析是鉴别白血病及其类型的重要手段之一，流式细胞术(FCM)可以快速准确地进行细胞免疫表型分析，用于急性白血病(AL)的诊断，特别是在一些特殊类型急性白血病如急性髓细胞白血病(AML) M0、AML M7、急性杂合性白血病(HAL)、急性未分化型白血病(AUL)和侵袭性NK细胞白血病的诊断中占有重要地位。现将FCM在一些特殊类型AL诊断中的应用情况报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品，型号为Coulter Epics XL;AL表型分析试剂盒、荧光标记单克隆抗体(McAb)[FITC标记IgG、cMPO、CD2、CD3、CD5、CD7、CD13、CD14、CD20、HLA DR，PE标记IgG、cCD79a、CD10、CD19、CD33、CD34、CD41、CD(16+56)，PC5标记CD45，ECD标记IgG、cCD3]、红细胞裂解液及标准荧光微球均为美国Beckman Coulter公司产品。

　　1.2 样本及处理

　　369例AL患者均为2003年11月20日至2008年2月15日在本院经形态学分析诊断为AL的患者，其骨髓或外周血样本经肝素抗凝，室温放置48h内按试剂盒说明进行操作并上机分析。

　　1.3 FCM分析

　　流式细胞仪用标准荧光微球进行调试，以CD45设门找到原始细胞群(图1)，分析原始细胞胞膜或胞浆抗原的表达情况。

　　图1 SS/CD45 PC5，A门为原始细胞群

　　2 结 果

　　按惯例，胞膜抗原髓系标记阳性率≥20%、淋系标记阳性率≥30%或胞浆抗原阳性率≥10%为阳性诊断标准[1]。另外，按Catovsky的系属积分标准[2]，淋系和髓系的各自积分均≥2分者，符合HAL的诊断(有双表型、双系列和双克隆的可能)。AUL基本上无淋系和髓系相关抗原的表达。本研究共对369例形态学诊断为AL的患者进行了FCM免疫表型分析，结果如下。

　　2.1 AML M0

　　2例患者原始细胞形态类似原始淋巴细胞，细胞化学染色过氧化酶(POX)、苏丹黑B(SBB)和特异性酯酶(CE)均为阴性反应，糖原染色(PAS)为阳性反应。免疫分型结果：CD34+,cMPO+,CD33+,CD13+/-(图2),CD14-,cCD3-,CD2-,CD5-,CD7+,cCD79a-,CD10-,CD19-,CD20-,CD41-,CD(16+56)-。即髓系表达，B淋系不表达，T淋系主要不表达，仅表达CD7，符合AML M0诊断。

　　2.2 AML M7

　　1例患者原始、幼稚细胞经形态学分析疑为小巨核细胞，通过免疫分型证实白血病细胞表达CD41(图3)，其余髓系、淋系均不表达，符合AML M7诊断。

　　2.3 HAL

　　1例患者原始细胞形态(细胞化学染色POX阳性率11%)似AML M1,免疫分型结果显示，大多原始细胞(58.1%)表达cCD3，同时部分(33.8%)原始细胞表达cMPO(图4)，此外，CD13+,CD2+,CD7+，符合HAL诊断。

　　2.4 AUL

　　5例患者白血病细胞形态多似原始淋巴细胞，其中有1例患者部分原始细胞浆中还可见少量极细小紫红色颗粒，但是细胞化学染色全部为阴性反应。免疫分型结果：CD34+/-,HLA DR+/-,cMPO-,CD33-,CD13-,CD14-,cCD3-,CD2-,CD5-,CD7-,cCD79a-,CD10-,CD19-,CD20-,CD41-,CD(16+56)-,CD41-，符合AUL诊断，见图5、6。

　　2.5 侵袭性NK细胞白血病

　　2例患者经过细胞形态学分析符合急性淋巴细胞白血病(ALL)，免疫分型结果显示，其中1例HLA DR+、CD(16+56)+，另1例仅CD(16+56)+(图7)，其他均不表达，符合侵袭性NK细胞白血病诊断。

　　3 讨 论

　　迄今为止，细胞形态学分型诊断仍然是AL的最基本诊断方法，但是仅靠形态学诊断往往会出现错误的结果[3]，随着白血病免疫分型特别是白血病MICM(形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学)分型的应用，对AL的白血病细胞来源与本质已逐步认清。本研究共对369例形态学诊断为AL的患者进行了FCM免疫表型分析，其中2例诊断为AML M0，1例诊断为AML M7，1例诊断为HAL，5例诊断为AUL，2例诊断为侵袭性NK细胞白血病，而1999年以前(本院未开展白血病免疫分型)的AL，依靠形态学分析只诊断了1例AML M7，无急性非淋巴细胞白血病(ANLL) M0、HAL、AUL和侵袭性NK细胞白血病诊断，究其原因应是条件限制使这些AL多归入了AAL。

　　因此，我们认为在下列几种情况下，免疫分型将尤为重要(甚至是必做不可的)[4]：(1)形态学和细胞化学染色不能确定白血病细胞系列;(2)形态学似ALL;(3)AML M0、AML M7、HAL、AUL和侵袭性NK细胞白血病等的确诊。

　　AML M0是由Lee等1987年首先提出的AML中的一种特殊类型，1991年Bennett建议将此型称为AML微分化型(M0)并提出相应的诊断标准[5]，同年FAB协作组正式将其增列为AML的一个独立类型。2001年Kaleem和White[6]提出的诊断标准强调免疫组化染色POX和SBB阴性或阳性率小于3%，免疫分型缺乏淋系抗原表达(cCD79a-,cCD3-),髓系抗原表达阳性。AML M7，又称ANLL M7、急性巨核细胞白血病(AMKL)，其免疫表型特征是表达CD41或CD42，过去少见，原因是用光学显微镜和常规细胞化学染色难以确诊，随着电镜特别是免疫表型分析的应用，证实了其并非少见，诊断标准[7]要求有电镜和McAb证实，而电镜对于一般医院尚未普及，所以免疫学检查显得尤为重要。HAL是一组十分异质性的疾病，有双表型、双系列和双克隆的可能，也只有在白血病免疫分型开展以来，本病才被认识。AUL特点是无粒系和淋系抗原的表达，但可以有某一非主要系性抗原(如HAL DR、CD7、CD34等)呈阳性表达[1]，本研究中1例患者FCM分析结果显示其系属抗原均为阴性表达，免疫学得出AUL诊断。另外，对于AUL，在形态学分析过筛的基础上,必须选用足够品种的McAb，以防误诊。侵袭性NK细胞白血病多发于年轻人，亚洲较欧美多见[8]，其诊断主要根据免疫表型(CD3、CD16、CD56)证实NK细胞起源而明确。

　　值得注意的是，在HAL的诊断中，对于Catovsky的某一系属积分≥2分，而另一系属积分不足2分(仅异常表达个别次要系列相关抗原)，不能诊断为双系列或双表型白血病，应诊断为Ly+AML或My+ALL[9]。由于白血病细胞起源和分化非常复杂，HAL有时可能并不是仅表现为单纯的双克隆、双系列或双表型，而是几种类型的混合型，事实上HAL的确切分类相当困难，有待进一步研究。

　　FCM用于细胞免疫表型分析，与常规免疫学方法相比具有快速、准确、可同时进行多参数分析等优点，目前在国内外大型医院已经广泛用于临床检验，在AL特别是一些特殊类型白血病的诊断中正发挥着越来越重要的作用。

　　【参考文献】

　　[1]陶德定，舒丹，李方和，等.流式细胞术用于混合型白血病及急性未分化型白血病的诊断[J].同济医科大学学报,2000,29(1):21 22.

　　[2]Catovsky D,Matutese E.The classification of acute leukemias[J].Leukemia,1992,6(2):1 6.

　　[3]吴雨洁，李建勇，宋君红，等.四色流式细胞术免疫分型在成人急性髓系白血病诊断中的应用[J].中华检验医学杂志,2006,29(8):750 752.

　　[4]宣恒报，李玉峰，于亮，等.94例急性白血病单克隆抗体免疫组化法检测结果分析[J].中国实验诊断学,2001,5(4):15 16.

　　[5]Bennett J M,Catovsky D,Dantel M T,et al.Proposal for the recognition of minimally differential acute myeloid leukemial(AML M0) [J].Br J Hematol,1991,78(3):325 329.

　　[6]Kaleem Z,White G.Diagnostic criteria for minimally differential acute myeloid leukemial(AML M0) [J].Am J Clin Pathol,2001,115(6):876 884.

　　[7]胡翎群.现代血液学检验与临床实践[M].上海:上海科学技术文献出版社，1999:19.

　　[8]沈志祥，朱雄增.恶性淋巴瘤[M].北京:人民出版社，2003:570 575.

　　[9]肖志坚，郝玉书.免疫表型分析与急性白血病诊断[J].中华血液学杂志,1997,18(1):53 54