不同方法检测同种异基因造血干细胞移植受者巨细胞病毒感染的探讨

　　作者：张龙天莉， 周健， 魏旭东， 蒋东霞， 程爱民， 胡杰英， 郭淑利， 朱兴虎， 宋永平 作者单位：河南省肿瘤医院血液科， 河南省血液病研究所， 郑州 450008

　　【摘要】 　　本研究探讨同种异基因造血干细胞移植(alloHSCT)后早期有效检测巨细胞病毒(CMV)感染的方法。应用荧光定量PCR和ELISA试剂盒分别检测19名alloHSCT受者，214份标本的血浆DNA负荷量和血清IgM抗体，同时应用流式细胞术检测188份标本白细胞pp65抗原。结果表明： pp65抗原、DNA定量和IgM抗体的阳性检出率分别为30.85% (58/188)、35.51% (76/214)和13.08% (28/214)，连续阳性病例和临床诊断的符合率分别为7/8、7/8和3/8。DNA定量与pp65抗原阳性检出率的差别无统计学意义(P>0.05)，但两种检测方法有明显的相关性(P<0.05)。IgM抗体阳性检出率明显低于DNA定量和pp65抗原，其差别均有统计学意义(P<0.05)，与另两种检测方法虽有关系，但不密切。结论：流式细胞术和荧光定量PCR检测alloHSCT受者CMV早期感染可靠、简便快速，值得临床推广使用。

　　【关键词】 巨细胞病毒感染,同种异基因造血干细胞移植,流式细胞术; 荧光定量PCR; pp65抗原

　　Abstract The aim of study was to explore the better detection method for cytomegalovirus (CMV) in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT) recipients and to compare the efficiency of fluorogenic quantitative PCR (FQPCR), flow cytometry (FCM) and ELISA. The plasma DNA loading and serum level of IgM antibody against CMV in 214 clinical specimens from 19 alloHSCT patients were detected by realtime FQPCR and ELISA respectively, the pp65 antigen in 118 peripheral blood leukocyte samples were measured by FCM. The results showed that the positive rates of pp65 antigen, IgM antibody and DNA load were 30.85% (58/188), 13.08% (28/214) and 35.51% (76/214) respectively, the coincidence between their sequential detection positive rates and clinical diagnosis were 7/8、7/8 and 3/8 respectively. There was no statistical significant difference between the positive rate of pp65 antigen and of DNA amount (P>0.05), and they have manifested relationships (P<0.05). The positive rate of IgM antibody detected by ELISA was obvious lower than that of DNA quantitated by FQPCR and pp65 antigen detected by FCM, but the difference between them showed statistical significance (P<0.05), Smaller relativity was found between IgM antibody detection and the other two methods (P>0.05). It is concluded that FQPCR and FCM are sensitive, rapid, suitable and reliable methods for monitoring recipient reactive CMV infection of alloHSCT recipients and are worthy to extensively use for guiding antiviral therapy.

　　Key words cytomegalovirus infection; alloHSCT; flow cytometry; fluorogenic quantitative PCR; pp65 antigen

　　J Exp Hematol 2007; 15(3):558-562

　　近年来，新型免疫抑制剂的出现及多种免疫抑制剂联合应用同种使异基因造血干细胞移植(alloHSCT)得到快速的发展，非血缘关系造血干细胞移植、单倍体造血干细胞移植、非清髓造血干细胞移植已广泛开展。alloHSCT受者中人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, CMV)感染极为普遍[1]，活动性CMV感染是继发曲霉菌、细菌混合感染的高危因素，且不易与细菌和真菌感染区别;其引起的间质性肺炎是器官移植失败重要原因之一[2]。更昔洛韦(ganciclovir, GCV)的使用使CMV疾病的治疗有了较大转机。目前有两种预防CMV感染的方法，其一是对具有CMV感染危险因素的患者给予GCV预防性治疗，时间一般为2-4个月。预防性治疗能有效预防CMV疾病，但也存在着明显的缺点。GCV使移植后造血重建时间延长,可以导致更多的细菌和真菌感染;部分患者可能接受了不必要的治疗，增加了经济负担;另外，GCV还干扰机体对CMV特异性免疫反应。另一种是，移植后受者出现CMV活动的证据，但无临床表现，给予GCV预先性治疗。但取得预先性治疗疗效的切入点还在于早期发现CMV活动性感染，CMV多引起潜伏感染，早期所致疾病的临床表现多为非特异性，所以早期诊断主要依靠实验室检查。因此，建立早期快速、灵敏特异、可靠的CMV检测和鉴定方法，提高检测效率是所有环节的关键。本研究应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IgM抗体，流式细胞技术(FCM)检测白细胞pp65抗原，荧光定量PCR(FQPCR)检测血浆DNA定量，旨在探讨早期有效诊断alloHSCT后受者CMV感染的方法。

　　主要试剂与仪器

　　酶联免疫检测仪(芬兰产品)、荧光定量PCR检测仪(日本大和公司产品)、流式细胞仪(Beckman Coulter公司产品)、人类巨细胞病毒核酸扩增荧光检测试剂盒(罗氏公司产品)、巨细胞病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒(上海森雄公司产品)、细胞破膜剂、鼠抗CMV pp65 C10/C11抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG1抗(荷兰IQ公司产品)、溶血素(Beckman Coulter公司产品)、鼠IgG1抗原、磷酸盐缓冲液(PBS， 0.01 mol/L，pH 7.4)、0.2%多聚甲醛、淋巴细胞分离液(比重1.077g/L)。

　　标本来源

　　214份外周血标本取自2003年10月至2005年8月在我科进行alloHSCT的19名受者，其中男12例，女7例，中位年龄33(3-49)岁。19例患者中慢性粒细胞白血病9例(慢性期6例，加速期2例，急性变期1例，为同基因造血干细胞移植术后复发急性单核细胞白血病)，非霍奇金淋巴瘤1例，急性髓系白血病6例(AMLM1 2例，AMLM2 3例， AMLM5 1例)，急性淋巴细胞白血病2例，重型再生障碍性贫血1例。同胞HLA相合移植11例，非血缘关系移植4例，单倍体相合移植3例，非血缘脐血移植1例。于GCSF动员供者外周血干细胞前、受者预处理前常规检测血清CMV IgM抗体，排除供者或受者CMV IgM抗体阳性的移植病例。回输当天及回输后每7天左右采集1次标本。给所有受者输注的血液成分均经60Co照射。回输后至造血恢复前粒细胞太低，白细胞pp65抗原无法检测，须在造血恢复后进行，共检测118份标本。

　　血清IgM抗体的ELISA检测

　　按试剂盒说明操作和判定结果。将被检患者血清用生理盐水1∶20稀释，取10 μl加入96孔板中，每份标本设3个复孔，然后加入20 μl标本稀释液，混匀。阴性、阳性对照孔直接加入30 μl对照血清，不加标本稀释液，37℃温育40分钟。用洗涤液充分洗涤反应板3次，用滤纸印干。每孔加IgM抗原—酶结合复合物20 μl，37℃作用20分钟。充分洗涤反应板3次，印干。每孔加入10 μl底物液A和10 μl底物液B，于室温避光反应10分钟。每孔加终止液30 μl，用波长450 nm酶标仪，以空白孔校正，分别测定阴性、阳性对照和被检标本各孔OD值。计算P/N值=被检血清平均OD值/阴性对照孔平均OD值;P/N≥2.1为阳性，<2.1为阴性。

　　血浆DNA含量的荧光定量PCR检测

　　引物和探针 参照CMV AD169株基因组序列及Towne株MajorIE基因序列exon4设计引物。在AD169株全序列中，上游引物位于171231-171252 bp处，下游引物位于171117-171136 bp处，探针位于171182-171206 bp处。在MIE exon4区域内，引物上游始于987 bp处，下游终止于1122 bp处。扩增区段共136核苷酸。在此区内，AD169株和Towne株同源性为100%。上游引物Pa：5′GACTATCCCTCTGTCCTCAGTA3′，下游引物Pb：5′AGACACTGGCTCAGACTTGA3′。荧光探针：5′CCTCATCACTCTGCTCACTTTCTTC3′，5′端标记荧光报道基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团ROX。

　　分离DNA 取2 ml静脉血EDTA抗凝， 1 000×g离心20分钟，取100 μl血浆与100 μl DNA提取液1振荡混匀。 820×g离心15分钟，弃上清。加入50 μl DNA提取液2，振荡混匀。100℃沸水浴/干浴10分钟， 820×g离心10分钟，保留上清待用。对照样品不加提取液。

　　扩增前准备 在每个反应管中加入PCR反应液35.6 μl(包括10×PCR buffer、dNTPs、MgCl2、荧光探针、上下游引物和PCR级水)、Taq酶0.4 μl、UNG 0.06 μl，整个反应体系为40 μl。充分混合均匀;阴性、阳性对照管分别加4 μl标准对照样品，和待测试反应管一起13 00×g离心10秒。

　　PCR扩增 循环条件为37℃ 5分钟;94℃ 1分钟;95℃ 5秒;60℃ 40秒;42个循环。60℃收集荧光信号，增益区间根据建议值设定。以DNA负荷量>103copies/ml或Ct值≤37.0为阳性。

　　血pp65抗原的流式细胞术检测

　　分离白细胞 取静脉血3-5 ml，肝素钠或EDTA抗凝，常规采用淋巴细胞分离液分离白细胞，PBS洗涤1次。

　　固定和破膜 细胞沉淀加0.2%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤1次，去上清，再加溶血素及细胞破膜剂各500 μl作用10分钟，用PBS洗涤1次，去上清，细胞沉淀用PBS制成浓度为107/ml的单细胞悬液。

　　荧光标记 将破膜后的细胞分为2管，1管作为测试管加入鼠抗CMV pp65 C10/C11抗体50 μl，另1管加入50 μl鼠IgG1抗原作为同型对照。作用30分钟后用PBS洗涤1次，每管加入FITC标记的羊抗鼠IgG(二抗)，避光反应30分钟，用PBS洗涤2次，去上清，然后加入500 μl PBS混匀细胞。

　　流式细胞仪检测 用流式细胞仪和CellQuest软件获取2×104个白细胞，采用CellQuest软件分别白细胞进行分析，计算阳性细胞百分数。

　　pp65阳性率=(测试管阳性率-同型对照管阳性率)×100%，≥0.5%为阳性

　　上述3种方法连续3次检测阳性受者，即可诊断为CMV活动性感染。

　　活动性CMV感染诊断标准[3]

　　发热伴白细胞减少，或伴间质性肺炎、胃肠炎、肝炎、视网膜炎，抗CMV治疗有效。

　　统计学处理

　　应用SPSS 12.0统计软件分析数据，采用一般χ2检验比较不同检验方法的结果关联性;用McNemer χ2(χ2m)比较其差异性，以a=0.05作为显著性差异的检验水准。

　　结 果

　　临床观察和检测结果

　　根据临床情况有8例患者诊断为CMV活动性感染，pp65抗原、DNA定量、IgM抗体拟诊符合情况者分别为7例、7例和3例;1例患者DNA定量间断性阳性，但临床随访3个月后发展成为CMV病。3种方法的阳性检出率分别为30.85%(58/188)、35.51%(76/214)和13.08%(28/214)。

　　DNA定量、pp65抗原、IgM抗体检测结果三者之间关联性和差别性

　　DNA定量和pp65抗原阳性检出率间的差别无统计学意义(P>0.05)，两种检测结果之间有明显的相关系性(P<0.05)。IgM抗体阳性检出率明显低于DNA定量和pp65抗原，其差别均有统计学意义(P<0.05);与另两种检测方法虽有关系，但结合Pearson列联系数P=0.1887，相关关系不显著(表1、2)。DNA定量和pp65抗原检测法明显优于IgM抗体检测法。

　　讨 论

　　CMV感染非常普遍，机体免疫功能正常时CMV在感染细胞内以整合状态潜伏存在，复制水平低下，通常表现为无症状或轻微症状的潜伏感染。机体免疫功能受到抑制时，CMV可被再次激活，从而持续高水平地复制，进而引起一系列有严重临床症状的CMV感染性疾病，甚至导致死亡。alloHSCT后8-10月内，受者白细胞虽在数量上已重建，但机体免疫功能尤其是细胞免疫尚未恢复，体内潜伏的CMV或经输血或从供者细胞获得的CMV易被激活，导致CMV活动性感染。CMV活动性感染除了引起CMV间质性肺炎外，还能诱导移植物抗宿主病(GVHD)的发生，影响干细胞植入，使造血重建延迟。

　　早期诊断CMV活动性感染主要依靠实验室检查，但目前诊断方法多种多样，哪种方法更能简便快捷、灵敏可靠，为临床提供预先性治疗的证据存在很大争议。最近发展的FQPCR减少了潜伏感染所致的假阳性结果，成为一种重要的方法[4]，国外将其作为器官移植受者CMV感染诊断的首选方法。FQPCR因省去了处理扩增产物和冗长的电泳使检测迅速;整个过程在完全闭管状态下进行，极大地降低了因污染造成的假阳性;仪器能测定产物的荧光信号，并自动收集、分析数据，结果客观可靠。本研究应用FQPCR检测19位受者214份标本，其中7例受者为持续阳性，DNA拷贝数持续递增，大于103copies/ml，并最终发展为CMV病;经GCV治疗1-2周后DNA均转阴。这和CMV病的临床诊断符合率达87.5%，另有1例患者DNA定量间断阳性，没有给予预先性治疗，随访3个月后发展为CMV病。尽管我们观察的病例数还不多，但已经显现出DNA定量检测的准确性。同时暗示血浆DNA定量间断阳性的患者也应进行预先性治疗。本研究中FCM检测pp65抗原和DNA定量的阳性检出率分别为30.85%(58/188)和35.51%(76/214)，二者之间差异没有显著统计学意义，两种检测结果间有明显的相关性。Caliendo等[5]应用血浆DNA定量和pp65抗原血症法同时监测29名移植受者491份标本的CMV感染情况，亦发现相似的结果。Tanaka等[6]认为，抗原免疫组织化学检测法受白细胞数量影响较大，特别不适用于HSCT后低细胞期CMV活化的早期诊断，而血浆FQPCR不仅极少受白细胞影响，而且由于扩增的是血浆游离病毒，更能代表CMV活化及复制水平。另外，定量PCR能表明机体组织中CMV的含量和活动状态以及与CMV病之间的风险关系，可预示CMV病的进程，指导临床用药和监测疗效。

　　潜伏感染时CMV以基因或基因产物存在，一旦潜伏的CMV被激活，其核酸和蛋白的含量均会增加。pp65抗原是UL83基因编码的即刻早期蛋白，在DNA复制前就有合成，激活感染后快速核转移，调控随后的病毒基因表达和DNA合成，与病毒侵入与复制启动有关，是体内活动性CMV复制的标志。因此，CMV潜伏感染时pp65蛋白表达极低，一般检测不到，激活感染时持续高水平表达，而且pp65抗原血症可在激活感染早期即呈阳性[7]。pp65抗原的检测方法有两种，其一是用针对pp65的单克隆抗体通过酶染或荧光免疫组织化学技术检测外周血白细胞pp65抗原，另一方法即本实验所采用的FCM测定白细胞中pp65阳染细胞百分率。本研究应用FCM检测19位受者188份标本，7例持续阳性，经GCV治疗1-2周后pp65抗原转为阴性。与临床诊断符合率高达87.5%。本实验显示，DNA定量和FCM检测pp65抗原的结果间有明显的相关性，提示pp65抗原可以作为FCM检测CMV活动性感染的诊断指标，该结果与国外Essa等报道一致[8]。另一项研究发现[9]，FCM检测CMV抗原血症与普通抗原血症法、定性PCR相关性较高，且敏感性最高，并提出当阳性细胞比例大于0.2%时，应高度怀疑存在活动性CMV病。但根据我们的经验，用0.5%作为临界值更合适。另外本试验中所用pp65抗体为C10和C11单克隆抗体的混合物，2株单克隆抗体分别针对pp65不同的抗原决定簇，两者混合可以提高检测的敏感性。FCM检测CMV抗原血症克服了普通抗原血症法的主观性，其操作更简便，更易标准化，检测的白细胞数量更大，并可快速定量受染细胞数。当病毒核酸与多形核细胞间失去关联时，PCR、RTPCR不能确定细胞是否受染，但FCM分析可克服该缺点。

　　CMV原发感染或潜伏-再激活感染时，体内可产特异IgM，且IgM存在一般不超过16周，所以IgM一直被视为原发感染或活动性感染的指标，血清IgG只能表示是否感染过CMV。本实验IgM的阳性检出率较低，IgM的量不仅与病毒负荷有关，还与患者免疫功能状态有关，alloHSCT后免疫抑制剂的应用使免疫功能低下，也影响IgM检测的敏感性和特异性。有时即使发生严重的CMV感染，IgM也始终不出现。因此，CMV抗体测定在诊断CMV感染中的价值受到限制。Bendiksen等[10]认为，人血清IgM与DNA间无相关性，不能作为器官移植受者CMV活动性感染的指标。尽管如此，CMV血清学检测在干细胞移植时仍不可缺少，如供者阳性/受者阳性，受者极易发生CMV病。因此血清学检测在选择合适供者、筛选血制品、判断患者预后方面仍有重要的价值[11]。

　　本研究资料显示，FQPCR检测血浆DNA含量和FCM检测pp65抗原血症是两种敏感特异、快速简便的CMV诊断新方法，其量化结果不仅有助于早期诊断治疗，而且对评估CMV感染状态、监测药物疗效、判断预后和减少药物滥用方面有重要的指导作用。

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