PDCD5在成人急性髓性白血病骨髓细胞的异常表达

　　作者：阮国瑞，陈珊珊，马曦1，常艳，王卉，付家瑜，秦亚溱，李金兰，刘艳荣 作者单位：北京大学人民医院、血液病研究所 ，北京 100044; 1北京大学疾病基因研究中心，北京 100083

　　【摘要】 　　为了研究成人急性髓性白血病(acute myeloid leukemia， AML)骨髓细胞凋亡促进分子——PDCD5的表达，以探讨PDCD5在AML发病机制中的作用，利用21种不同荧光标记的单克隆抗体标记骨髓细胞，通过流式细胞术检测AML病人及正常人骨髓不同群细胞的胞内PDCD5的表达。部分标本进行蛋白印迹实验检测AML病人及正常人骨髓细胞内PDCD5的表达。结果表明：36例未治AML病人骨髓总的有核细胞内PDCD5平均荧光强度明显低于30例正常人组，分别为3 059±1 392：7 432±1 261(P <0.01)，其中未治AML病人骨髓粒细胞、单核细胞、幼稚细胞及淋巴细胞内PDCD5平均荧光强度均低于相应的正常人组骨髓细胞，分别为3 939±2 121：8 367±1 045;3 156±1 635：5 917±2 329;2 824±1 592：3 998±2 106;1 474±816：3 355±2 042(P值均小于0.01)。部分标本进行蛋白印迹检测的结果也显示AML病人骨髓细胞内PDCD5的表达低于正常人。结论：未治AML病人骨髓总有核细胞的PDCD5表达低于正常人，未治AML病人骨髓粒细胞、单核细胞、幼稚细胞及淋巴细胞内PDCD5表达均低于正常人组骨髓细胞。PDCD5的异常表达可能在AML的病理机制中起到一定的作用。

　　【关键词】 急性髓性白血病,PDCD5 骨髓细胞,细胞凋亡

　　Abstract The objective of this study was to estimate a novel apoptosispromoting molecule PDCD5 expression in the bone marrow cells from adult acute myeloid leukemia (AML) for investigation of its significance in the pathogenesis of AML. Flow cytometry assay was used for detection of PDCD5 expression in the different groups of cells from bone marrow of AML patients and normal controls by using 21 monoclonal antibodies with different fluorescent markers. The PDCD5 expressions in bone marrow cells from some AML patients and normal controls were also detected by Western blot. The results showed that the mean PDCD5 fluorescence intensity in bone marrow nucleated cells(MNC)from the bone marrow of 36 untreated AML patients was significantly lower than that from the bone marrow of 30 normal controls ( 3059±1392) vs (7432±1261)(P<0.01). The mean PDCD5 fluorescence intensity was lower in the marrow granulocytes, monocytes, blast cells, and lymphocytes from untreated AML patients than that from normal (3939± 2121) vs (8367±1045); (3156±1635) vs (5917±2329); (2824±1592) vs (3998±2106); (1474±816) vs (3355±2042) respectively, (all P<0.01). Western blot analysis demonstrated that PDCD5 expression was significantly decreased in the AML cells, as compared with normal cells. It is concluded that PDCD5 expression in MNC in untreated AML patients is lower than that in the normal. PDCD5 expression in the marrow granulocytes, monocytes, blast cells, and lymphocytes of untreated AML patients is significantly lower than that in the normal. It suggests that the abnormally low expression of PDCD5 may be involved in the pathogenesis of AML.

　　Key words Acute myeloid leukemia; PDCD5; bone marrow cell; apoptosis

　　J Exp Hematol 2007; 15(3):462-465

　　急性髓性白血病(acute myeloid leukemia， AML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，其病理特征是原始与早期的幼稚细胞在骨髓中急剧增生，其病因尚未完全明了。TF1细胞凋亡相关基因19(TF1 cell apoptosisrelated gene 19, TFAR19)是最近发现的一种新的凋亡调控基因[1]国际人类基因命名委员会将其命名为PDCD5(programmed cell death 5), 其编码的蛋白主要定位于细胞内，在人类50余种组织中广泛分布。我们以前的研究发现，PDCD5蛋白的异常表达可能在慢性髓性白血病疾病进展中起一定作用[2]，但在AML病人细胞中是否存在异常表达，尚不清楚，本研究应用流式细胞术标记技术，首次研究了成人AML与正常供者骨髓(normal donor marrow， NDM)不同细胞群胞内PDCD5的表达情况。

　　研究对象

　　成人未治AML病人骨髓标本36份， AML病人治疗后部分及完全缓解的骨髓标本18份;AML诊断及分期依据国际标准;同种异基因骨髓移植供者骨髓30份作为正常对照。

　　材料

　　牛血清白蛋白(BSA)购自军事医学科学院药材供应站。标记不同荧光的小鼠抗人单克隆抗体CD45PerCP(多甲藻叶绿素蛋白)、CD7FITC(异硫氰酸荧光素)、CD117PE(藻红蛋白)、 CD33APC(别藻蓝蛋白)、CD34FITC、CD10PE、CD19APC、CD38FITC、CD56PE、 HLADRAPC、CD13FITC、CD64PE、CD11bAPC、CD14APC、CD15 FITC、CD71FITC、CD16 FITC 胞浆MPOFITC及小鼠IgGFITC、IgGAPC、IgGPE共21种均购自Becton Dickinson及PharMingen公司。FITC标记的小鼠抗人单克隆抗体PDCD5由北京大学人类疾病基因研究中心馈赠[3]。FACSTM permeabilizing solution， FACS lysing solution购自美国Becton Dickinson公司。

　　流式细胞术分析

　　无菌采集的骨髓标本，常规肝素抗凝， 每管取10-100 μl(约含细胞5×105-1×106)，分别按如下6管进行3-4色荧光抗体标记(抗体加入量按公司说明书进行)。1号管：CD45PercP / IgGFITC/ IgGPE/ IgGAPC; 2号管：CD45PercP / CD7FITC / CD117PE / CD33APC; 3号管：CD45PercP / CD34 FITC / CD10PE / CD19APC; 4号管：CD45PercP / CD38FITC / CD56PE / HLADRAPC; 5号管：CD45PercP / CD13FITC / CD64PE / CD11bAPC; 6号管：CD45PercP 。

　　室温避光保存20分钟后，用红细胞裂解液(FACS lysing solution)溶解红细胞，用0.067 mol/L的PBS(含5 g/L BSA)洗涤，2、3、4、5号管补充0.067 mol/L PBS 500 μl准备上机;1、6号管各加500 μl破膜剂(FACSTM permeabilizing solution)破膜10分钟，用0.067 mol/L的PBS(含5 g/L BSA)洗涤后，6号管中加入5 μl FITC标记的小鼠抗人单克隆抗体PDCD5，用0.067 mol/L的PBS(含5 g/L BSA)洗涤后，补充0.067 mol/L的PBS 500 μl准备上机(其中4及5号管根据1、2、3号管上机结果可分别另选CD15 FITC/ CD71FITC/ CD16 FITC /胞浆MPOFITC /CD14 APC进行标记)。

　　根据FCM散点图，以1号管为阴性对照，对2、3、4、5、6号管以CD45/SSC分别设门后，依据各群细胞CD45/SSC特性及表达CD分子不同[4]，可将散点图划分为五个群体，分别为幼稚细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及有核红细胞(图1)，然后用FCM软件cellquest计算测定管中总的有核细胞及各群细胞的PDCD5表达百分率及每个细胞的平均荧光强度。图2显示流式细胞术检测1例未治AML病人骨髓不同群细胞内PDCD5表达百分率(a)及平均荧光强度(b)。

　　Figure 1. CD45/SSC dotplot of an untreated AML patient marrow cells tested by flow cytometry. Each dot represents a cell. The plot can be clearly divided into five groups after gating: R2: lymphocyte, R3: blast cell, R4: granulocyte, R5: monocyte, R6: nucleated erythrocyte.

　　蛋白印迹分析

　　参照文献[5]方法进行。简言之，收集AML病人及正常供者骨髓的单个核细胞，加入裂解缓冲液煮沸10分钟，行10% SDSPAGE电泳，每孔上样10 μg蛋白。通过电转移方法将蛋白转移到硝酸纤维薄膜，膜与1∶100稀释的PDCD5抗血清孵育过夜，在Odyssey图象分析系统上进行分析。

　　统计学分析

　　数据以±SD表示，采用单因素方差分析。

　　结 果

　　成人未治AML患者及同种异基因骨髓移植供者骨髓不同群细胞胞内PDCD5表达百分率均在95%以上，但PDCD5的平均荧光强度却明显不同(附表)。36例未治AML病人骨髓总的有核细胞内PDCD5平均荧光强度明显低于30例正常人组骨髓总的有核细胞的，分别为(3059±1392) vs (7432±1261)，(P<0.01)。其中AML未治病人骨髓粒细胞、单核细胞、幼稚细胞及淋巴细胞内PDCD5平均荧光强度均低于相应的正常人组骨髓细胞，分别为(3939±2121) vs (8367±1045);(3156±1635) vs(5917±2329);(2824±1592) vs (3998±2106);(1474±816) vs (3355±2042)，各P值均小于0.01(单因素方差分析)。蛋白印迹分析结果，显示与正常人骨髓细胞相比，AML病人骨髓细胞内PDCD5 表达较低(图3)。

　　讨 论

　　细胞凋亡(apoptosis)或细胞程序性死亡是基因控制的一种生理性死亡，是机体保持细胞数量相对稳定的重要的生理性调节过程[6，7]。AML是一种造血组织的恶性疾病，涉及多种形式的染色体易位和基因遗传学改变，其特征为骨髓或其它造血组织中白细胞和幼稚细胞(白血病细胞)恶性增殖，主要原因是造血细胞增殖失控与抗凋亡作用增强，凋亡抑制基因表达增强或凋亡活化基因受抑制，这被认为是急性白血病的发病机制之一。许多抗肿瘤药物包括放疗是通过促凋亡作用而发挥药效的[8]，因此，研究白血病凋亡的异常在阐明其发病机制、提高化疗效果以及寻求新的治疗途径等方面均有重要意义。

　　PDCD5是我国科学工作者在研究红白血病细胞株TF1细胞的凋亡相关基因中，首先发现的一种新的促凋亡分子(GenBank登记号为AF014955)，定位于染色体19q12 q13. 1 , cDNA 全长为559 bp ,包括6 个外显子,AATAAA 加尾信号和poly A尾, 编码125个氨基酸组成的PDCD5 蛋白。PDCD5 是一个表达广泛,进化保守的促凋亡分子,能促进多种细胞的凋亡,在凋亡过程中表达增加,并在凋亡早期有明显的核转位现象[3 。已发现PDCD5在实体肿瘤如肝细胞癌[9]、乳腺癌[10] 、卵巢上皮细胞癌[11]等低表达。我们以前的研究发现，PDCD5在慢性髓性白血病病人骨髓细胞中低表达，并可能在疾病进展中起一定作用[2]，在此基础上，本研究进一步检测了未治AML病人及正常人的骨髓不同群细胞胞内PDCD5的表达。结果发现，未治AML病人骨髓总的有核细胞内PDCD5平均荧光强度明显低于正常人组骨髓总的有核细胞的，其中未治AML病人骨髓粒细胞、单核细胞、幼稚细胞及淋巴细胞内PDCD5平均荧光强度均显著地低于相应的正常人组骨髓细胞。

　　为了探明PDCD5 mRNA水平是否在白血病骨髓细胞中异常表达，我们进一步建立了实时定量PCR的方法，以正常供者骨髓作为对照，检测了急性髓性白血病、慢性髓性白血病骨髓细胞的PDCD5的相对表达水平。 结果表明：PDCD5在急性、慢性白血病骨髓细胞的表达量明显低于正常人组，且CML病人 PDCD5表达量与BCRABL表达量呈负相关，在CML加速/急变期病人中更为明显[12]。结合本研究的结果，说明PDCD5在AML、CML病人存在 mRNA和蛋白水平的异常表达，可能在AML、CML病理机制或疾病进展中起一定作用。

　　体外实验表明, 将含TFAR19cDNA 的真核表达载体转染TF1等细胞后，可加速这些细胞的凋亡[1]。人重组PDCD5蛋白能够直接进入白血病细胞系HL 60, 发挥其促进细胞凋亡的效应[13]。不同质量浓度的人重组TFAR19蛋白对化疗药物羟基喜树碱诱导的肝癌细胞凋亡也具促凋亡效应，并且显示了明确的量效关系[14]。此外，PDCD5蛋白能明显增加γ射线诱导的乳腺癌细胞凋亡[15]及IFN γ诱导的宫颈癌细胞凋亡[16]，PDCD5作为肿瘤细胞的凋亡促进剂，可能在临床上具有潜在的应用价值。

　　致谢: 感谢北京大学人类疾病基因研究中心马大龙、陈英玉老师馈赠FITC标记的小鼠抗人单克隆抗体PDCD5，及在课题进行过程中给予的指导和帮助。

　　【参考文献】

　　1Liu H, Wang Y, Zhang Y, et al. TRAR19, A novel apoptosisrelated gene cloned from human leukemia cell line TF1, could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal. Biochem Biophy Res Commun, 1999; 254：203-210

　　2阮国瑞，陈珊珊，常艳等. 凋亡促进分子TFAR19在成人慢性髓性白血病骨髓细胞的异常表达. 北京大学学报·医学版，2002;34：676-679

　　3Chen Y, Sun R, Han W, et al. Nuclear translocation of PDCD5(TFAR19)： an early signal for apoptosis? FEBS Letter, 2001; 509：191-196

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