0DNA拓扑异构酶和端粒酶与白血病多药耐药关系

　　作者：李守娟,顾健　　作者单位：扬州大学临床医学院，扬州市血液研究所，扬州225001

　　【摘要】肿瘤细胞产生耐药性成为许多肿瘤治疗成败的关键，也是血液肿瘤化疗失败的重要原因，目前人们从不同的角度和水平对耐药的发生机制、逆转耐药的药物研究及相应的体内外实验等进行研究，指出多药耐药是多种因素共同作用的结果。近年来白血病的不典型耐药机制日益受到人们的重视，因此本文从DNA拓扑异构酶和端粒酶与白血病耐药的关系出发，阐述了白血病细胞多药耐药的抗凋亡机制，旨在为逆转白血病耐药及开发有效的逆转剂奠定理论基础。

　　【关键词】 DNA拓扑异构酶,端粒酶,白血病 多药耐药

　　Abstract The appearance of multidrug resistance becomes a key to treat many malignanccies, and also is an important factor in the failure of chemotherapy. Presently, the studies on multidrug resistance mechanism, reversor and associated exterior experiments in vivo and in vitro from different points of view and levels show that multidrug resistance is the result of common action in many factors. In recent years nonrepresentative mechanism of multidrug resistance becomes more and more significant. This review aims at establishing rationale basis for reversing multidrug resistance of leukemia and finding effective reversors by expounding the mechanism of apoptosis in drug resistance of leukemia with relation to DNA topoisomerase and telomerase activity.

　　Key words DNA topoisomerase; telomerase; leukemia; multidrug resistance

　　J Exp Hematol 2007; 15(1):207-210

　　多药耐药(multidrug resistance, MDR)是指肿瘤细胞或白血病细胞对一种化疗药物产生耐药后对其它结构、细胞靶点和作用机制不同的多种抗癌药物产生交叉耐药的现象。血液肿瘤化疗失败的重要原因之一就是白血病细胞对化疗药物的不敏感性即多药耐药性。目前白血病细胞多药耐药的机制主要有多药耐药基因(mdr1基因)及其编码的P糖蛋白(Pglycoprotein，Pgp)的过度表达;凋亡调控基因表达失控及相关酶的异常如谷胱甘肽酶活性增高，拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ )含量的改变等。此外，许多研究表明恶性血液病细胞中端粒酶活性增加亦会影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。因此，本文就DNA拓扑异构酶和端粒酶与白血病细胞多药耐药的关系作一综述，探讨不典型耐药机制在血液肿瘤中的作用，从而为克服耐药的发生，开发有效的逆转剂，提高临床疗效提供理论思路。

　　白血病细胞耐药与凋亡的关系

　　细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，由基因调控的主动的死亡过程。许多研究表明，某些抗肿瘤药是细胞凋亡的诱导剂，因此抗凋亡也许是限制某些化疗药物的有效性的主要因素。白血病细胞的多药耐药性可分先天性耐药与获得性耐药两大类。由于白血病的高复发率使获得性耐药成为治疗中的主要障碍，一般高剂量的化疗药物由于其非特异性及强的骨髓抑制等副作用限制了临床应用，而低剂量通常会使治疗效果不理想，并且导致病人的复发和肿瘤细胞逃避药物的毒性作用而导致耐药的产生。因此， 在防止不发生耐药的情况下，用相对低的既能抑制肿瘤细胞的增殖又对病人损伤小并能取得治疗疗效的化疗药物剂量的是人们追求的目标，而诱导肿瘤细胞凋亡以增强化疗药物的敏感性成为目前研究的重点之一。Xu等[1]探讨了白血病细胞多药耐药与细胞凋亡的关系，指出细胞的耐药性与凋亡抑制相关，诱导细胞凋亡能减低白血病细胞的MDR。DNA拓扑异构酶和端粒酶与白血病细胞的凋亡有密切的关系，同时对化疗的敏感性与病人的预后判断有着重要的指导意义，二者在耐药机制探讨及逆转剂的研究中有重要的价值。

　　DNA拓扑异构酶与凋亡

　　DNA拓扑异构酶(topoisomerase, Topo)是一种凋亡相关的、可催化DNA拓扑结构变化的核酸酶，它与DNA分子结合成“可断裂复合物”，介导DNA链的瞬间断裂与解螺旋后重接，在DNA的复制、基因转录、基因的修复与重组等方面发挥重要的作用。DNA拓扑异构酶分为DNA拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)和Ⅱ(TopoⅡ)两种类型，二者分别催化DNA单链与双链断裂再连接，均为抗癌药物作用的靶点，其中TopoⅡ是近年来研究最多的与染色质凝集和结构有关的核蛋白，它对分裂后期染色单体的正常分离及细胞遗传成分均等进入子细胞等生命活动十分关键。TopoⅡ能促使酶DNA易解离复合物形成，最终引起肿瘤细胞凋亡或死亡，其表达水平的下降可严重影响肿瘤对化疗的敏感性，其同工酶TopoⅡa作为细胞内的重要核酶参与了MDR的形成,其活性降低亦可影响许多抗癌药药效。Aoyama等[2]用对VP16敏感的HL60细胞及其耐药的HL60/DOX0.05细胞为对象，研究TopoⅡ抑制剂VP16诱导的DNA损伤与凋亡，并探讨了钙钙调节蛋白依赖酶抑制剂KN62对其作用的调节。结果表明，KN62调节VP16诱导HL60细胞凋亡仅在半数抑制浓度的S期;而在HL60/DOX0.05细胞，非细胞毒剂量2 μmol KN62可显著增加VP16的凋亡率，并且分别出现在G1、S和G2+M整个细胞周期，进而说明产生这种现象的机制与药物稳定DNA断裂复合体形成有关，KN62逆转耐药的效应在于以细胞周期依赖的方式，作为VP16的潜在增敏剂诱导DNA损伤与凋亡。有人进而用流式细胞术研究在VP16诱导白血病细胞凋亡过程中，药物对HL60细胞细胞周期的影响与线粒体转膜电位变化之间的关系：低浓度VP16(0.25-0.75 μmol)作用HL60细胞24小时，可使大量细胞停留在G2/M期，使线粒体膜电位显著增加，在0.75 μmol时，G2期细胞从16%增加到95%，G1和S期细胞逐渐减少;高浓度VP16(2-3 μmol)作用后，G2期细胞消失，在VP16浓度≥1 μmol时，细胞出现凋亡且呈细胞周期依赖性，线粒体膜电位则降低，这说明细胞周期的变化与线粒体膜电位的改变有相关性[3]。Meng等[4]探讨salvicine干扰TopoⅡ诱导细胞凋亡的可能机制，结果发现salvicine可诱导HL60细胞DNA损伤及早期DNA链断裂而启动凋亡过程，其引起DNA链断裂在凋亡调控基因cmyc的P2启动子区，从而抑制cmyc的表达，还可以诱导cfos和cjun基因转录的显著增加，并伴随有核小体间DNA ladder形成，这说明DNA损伤，尤其是某些基因特定区损伤是诱导细胞凋亡的早期信号，进而表明P2启动子的失活是抑制cmyc表达和肿瘤细胞生长的有效途径，Melixetian等[5]研究耐药的分子机制与染色体不稳定性的相关性，指出与亲代细胞相比较，对VP16耐药的细胞株K562/ VP 16及其克隆K562/VP161、K562/VP16 2 DNATopo Ⅱa的基因表达水平分别下降了84%、63%及87%，且三者均有抗凋亡基因bcl2 mRNA含量减少，凋亡前基因bax mRNA水平下调到无法测出，bclXL mRNA水平仅在K562/VP161细胞株显著减少，且在培养的早期，易于发生染色体的多倍体化，Topo Ⅱa表达水平的变化与K562/ VP 16细胞染色体的多倍体化发生率的增加呈正相关，从而证明了bcl2家族和Topo Ⅱa的表达的改变及染色体多倍体化的高发生率与K562细胞对VP16的获得性耐药有关。Dassonneville等[6]用Topo Ⅱ抑制剂——海水生生物碱ASC(ascididemin)对人Topo Ⅰ和Topo Ⅱ DNA链断裂的影响来研究其对白血病细胞的凋亡诱导作用，超螺旋DNA解旋实验表明，ASC可通过Topo Ⅱ促使DNA双链的断裂，对Topo Ⅰ仅有很微弱的作用，并且对敏感的HL60细胞及其耐药株HL60/Mito均有毒性。细胞周期分析表明，经ASC处理后亚G1期细胞从3%增加到70%，同时G1期细胞则显著地下降，进而证明了凋亡的诱导与caspase3的活化有关。LarocheClary等[7]用Topo Ⅱ抑制剂胺苯丫啶(amsacrine)、阿霉素、VP16对凋亡诱导作用的研究来阐明bcrabl表达在启动凋亡中的作用，结果表明胺苯丫啶与阿霉素在半数抑制浓度下，能使K562细胞bcrabl及abl基因表达最多减少20%，而对阿霉素耐药的K562细胞，胺苯丫啶可使bcrabl的表达下降80%，阿霉素则使其下降60%，二者均对正常的abl基因无作用;此外，胺苯丫啶还对敏感及耐药细胞bclXL的表达有影响，但作用浓度高于其IC50值，VP16则对凋亡基因表达均无影响，进而强调了bcrabl在使白血病细胞抗凋亡的过程中有重要的作用。Topo Ⅱ与肿瘤的发生发展及治疗和预后等方面有较密切的关系，其基因转录速度降低，等位基因甲基化或基因突变均可影响其表达，同时耐药的发生亦影响其疗效，开发对肿瘤特定的DNA拓扑酶抑制剂，诱导细胞凋亡及减少MDR发生有重要的意义

　　端粒酶与凋亡

　　端粒酶是一种由催化亚单位(human telomerase reverase transcriptase, hTERT)、RNA模板(human telomerase RNA，hTR) 和端粒酶相关蛋白1(telome rase associated protein 1,TP1)组成的核蛋白复合体，能以自身RNA为模板，合成(TTAGGG)重复序列，使真核细胞染色体末端的端粒长度免于降解和熔接，与肿瘤的形成和耐药有关。研究表明，包含模板区的结构RNAhTR和发挥逆转录活动的催化亚单位hTERT是促进酶活动的两大亚单位[8],其中hTR构成性表达在正常和肿瘤组织中[9]，而hTERT只表达在生殖细胞(germ line)和某些干细胞，并且几乎在肿瘤来源的永生化细胞中都表达。因此，hTERT与端粒酶活动关系密切[8]。端粒酶作为肿瘤细胞永生化的标志，降低其活性与诱导凋亡在逆转耐药中有重要的作用。Akiyama等[10]分别用hTERT和cMyc转染红白血病细胞K562。结果表明，hTERT转染的K562细胞对DNA合成抑制剂阿糖胞苷、羟基脲诱导的凋亡敏感，但对去除血清或双链DNA断裂诱导剂VP16等诱导的凋亡产生耐受，指出通过转染hTERT，使端粒酶过度表达，可导致端粒延长及对双链DNA断裂诱导剂的耐受。Zhang等[11]研究对复发和难治性早幼粒细胞白血病治疗有效的三氧化二砷(As2O3)与端粒酶抑制剂DODC(3，3，diethyloxadicarbocya nine)对细胞凋亡的作用，指出低剂量的As2O3可使细胞停留在G2/M期而诱导细胞的凋亡，DODC能以剂量依赖的方式抑制端粒酶的活动，使细胞停留在G0/G1期，其单独虽不能诱导凋亡的发生，但与As2O3合用可增加后者诱导凋亡的效应，从而为二者在临床中联合应用减少砷剂的毒副作用，发挥后者在癌症治疗中的潜能提供了有用的信息。Malerba等[12]探讨作用机制不同的紫杉醇和VP16对人骨髓细胞及人早幼粒白血病细胞株HL60的凋亡及其相关基因bcl 2、bax、bclx等表达、端粒酶活性及端粒长度的影响，结果表明在骨髓基质细胞中二药均可增加端粒的长度，并且伴随有bax、bclx、 bcl2表达的变化，紫杉醇可活化端粒酶，延长端粒，增加HL60细胞的稳定性而诱导耐药的发生;低浓度的VP16可活化端粒酶，而高浓度可使端粒酶的活性降低，下调bcl2，诱导HL60细胞凋亡与坏死。作者指出，端粒酶活性与凋亡有相关性，且二者似乎被共同的基因bcl2所调节。Liu等[13]研究抗癌药物诱导白血病细胞凋亡过程中端粒酶的调节机制，指出Topo Ⅱ抑制剂salvicine能以时间和浓度依赖的方式通过下调端粒酶的活性而诱导HL60细胞的凋亡，并且端粒酶活性的抑制先于其催化亚单位hTERT和端粒酶相关蛋白1TP1 mRNA水平的下降，表明除了端粒酶亚单位转录水平的下降外，salvicine诱导的端粒酶活性的下降可被其它制剂所调节，进而发现蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸(okadaic acid， OA)可阻止salvicine诱导的凋亡并且下调端粒酶活性，而salvicine诱导的蛋白磷酸酶2A(PP2A)明显增加可完全被OA所抑制，这些结果表明，salvicine诱导的端粒酶活性的下降不是HL60细胞凋亡的结果，也许主要是由PP2A活化介导的端粒酶成分的去磷酸化而引起的。Gunduz等[14]研究含有180多种包括类黄酮、石碳酸及石碳酸酯等成分的马尼萨蜂胶对急性T淋巴细胞白血病细胞株CCFRCEM端粒酶活性的影响，结果表明与对照组相比，蜂胶处理组细胞的hTERT比率在72小时内从195.56降至13.29，尤其在第一个24小时内下降最显著，分别达93%和60%，这表明蜂胶也许通过减少hTERT的水平抑制端粒酶的表达而发挥其抗肿瘤诱导细胞凋亡的效应，说明白血病细胞的凋亡与端粒酶hTERT表达关系密切。有人研究白血病细胞HL60凋亡过程中，凋亡调控基因bcl2表达与端粒酶活性的关系，证明了桦木醇酸的衍生物23羟基桦木醇酸可作为一种有效的细胞毒药物，以剂量和时间依赖的方式抑制细胞增殖，诱导细胞的凋亡，且凋亡过程中伴随有端粒酶活性的下降和bcl2表达的下调[15]。Liu等[16]研究α干扰素(αIFN)联合阿糖胞苷(AraC)对白血病K562细胞的诱导凋亡作用及其作用机制，观察了细胞端粒酶活性及凋亡调节基因P53蛋白的表达水平的变化，结果显示，10 mg/L以上的AraC作用24小时后均能不同程度的升高P53蛋白的表达水平，20 mg/L的AraC作用72小时后，P53蛋白的表达水平可达30%左右，其与αIFN联用可显著抑制细胞的生长，降低端粒酶活性，升高P53蛋白的表达水平，诱导凋亡的发生。同年，他们又探讨了具有广泛抗肿瘤作用的冬凌草甲(oridonin)对B淋巴细胞白血病细胞株Raji细胞的增殖抑制作用及其机制，分别用8、16及24 μmol/L浓度药物作用不同时间，结果发现作用48-60小时后凋亡细胞数量达高峰，且在凋亡过程中端粒酶活性下降，并呈现出一定的时间效应与剂量效应关系[17]。端粒酶活性增高与肿瘤的发生、发展密切相关，造血细胞增殖、分裂和失控是白血病生物学的重要特征之一，在不同类型的白血病及同一白血病的不同阶段，其活性各不相同，细胞凋亡是白血病细胞耐药的机制之一，研究其活性变化与凋亡的关系有着重要的意义，可为开发有效的低毒高效的逆转剂及临床应用提供理论依据。在许多白血病中可发现有细胞遗传学的改变，随着肿瘤细胞的无限增殖，端粒酶不断合成染色体末端的端粒而保持其永生化，拓扑异构酶是核基质成分之一，是一种调整DNA拓扑结构的核酶，参与了染色体组装、基因组复制及DNA重组等，因此端粒酶与拓扑异构酶在一定程度上使染色体发生突变而影响治疗的效果，导致耐药的发生。Serakinci等[18]研究发现，端粒酶阳性的病人初次治疗时染色体检查核型是正常的，17个月后再次检查发现多个染色体发生突变。诱导细胞的凋亡是逆转白血病细胞对化疗药物耐受的一条重要机制，拓扑异构酶和端粒酶与细胞的凋亡关系密切，二者作为白血病治疗的靶点有广阔的应用前景。目前，端粒酶活性的变化与白血病细胞凋亡的关系尚未完全阐明，是端粒酶活性降低导致肿瘤细胞发生凋亡,还是细胞凋亡后继发端粒酶活性下降，这一问题有待进一步研究。 现在普遍认为，拓扑异构酶抑制剂可导致Topo Ⅱ活性和含量的下降，导致肿瘤细胞DNA复制障碍，引起凋亡而达到抗肿瘤目的，但Topo Ⅱ活性和含量的降低又使得抗肿瘤药丧失了作用目标并产生耐药，因此需进一步加强对其作用机制的研究，为耐药机制的阐明及有效逆转剂研究提供新途径。

　　【参考文献】

　　1Xu WL, Jiang YW, Wang FC, et al. Study of relationship between multidrug resistance and apoptosis in leukemia cell line K562.J Leuk Lymph, 2003;12:351-353

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　　16Liu JJ, Wu XY, Pan XL, et al. Apoptotic effects and its mechanisms on leukemic K562 cells caused by interferonalpha combined with cytarabine. Chin J Cancer Biother, 2003 ;10:198-201

　　17刘加军, 潘祥林，伍新尧等. 冬凌草甲素对Raji细胞的增殖抑制作用及其机制. 中草药, 2004; 35: 774-777

　　18Serakinci N, Ostergaard M, Larsen H, et al. Multiple telomeric aberrations in a telomerasepositive leukemia patient. Cancer Genet Cytogenet, 2002;138:11-16