2例类孟买表型的分子机理研究

　　作者：和艳敏,许先国,朱发明,严力行　　作者单位：浙江大学医学院附属第一医院输血科，杭州 310003;　2浙江省血液中心输血研究所，卫生部血液安全研究重点实验室，杭州 310006

　　【摘要】 本研究探讨2例类孟买血型表型的分子机理。先证者样本通过血清学方法鉴定为类孟买血型，采用PCR扩增先证者的FUT1和FUT2基因编码区序列，并对PCR产物进行直接测序分析。同时FUT1基因PCR产物经TOPO TA转染克隆到质粒上分离后，对其进行测序分析，以证实突变在染色体上的位置。结果表明：直接测序发现2例先证者FUT1基因第547-552位AG两碱基缺失杂合(CAGAGAG→CAGAG)和第658位C→T杂合。克隆后证实一条染色体上FUT1基因第547-552位中的两碱基AG缺失，可导致阅读框架发生移码，提前形成终止密码;另一条染色体上FUT1基因第658位C→T 错义突变，导致第220位精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys)。 2例先证者FUT2基因均为357C→T同义突变。结论：2例先证者FUT1基因突变为不同染色体的复合性突变，均为h1h3。

　　【关键词】 类孟买型　α1,2岩藻糖基转移酶,FUT1基因;FUT2基因

　　Abstract This study was purposed to investigate the molecular genetics basis for paraBombay phenotype. The paraBombay phenotype of two probands was identified by routine serological techniques. The full coding region of alpha (1,2) fucosyltransferase gene (FUT1 and FUT2) in the probands was amplified by polymerase chain reaction and the amplified fragments were directly sequenced, meanwhile the mutations of FUT1 were also identified by TOPO TA cloning sequence method. The results indicated that two heterozygous mutations were detected by directly sequencing in two probands: AG deletion at position 547-552 and C to T mutation at position 658. Two different mutations were confirmed to be true compound heterozygotes with each mutation on a separate homologous chromosome by TOPO TA cloning sequence method. AG deletion at position 547-552 caused a reading frame shift and a premature stop codon. C658T mutation resulted in Arg→Cys at amino acid position 220. It is suggested that the FUT1 mutation of two probands are compound heterozygous mutation with different chromosomes, which are named h1h3 and may be the genetics basis of paraBombay phenotype.

　　Key words paraBombay phenotype; alpha (1,2) fucosyltransferase;FUT1 gene; FUT2 gene

　　J Exp Hematol 2007; 15(3):626-629

　　类孟买表型是一类罕见的红细胞血型，其主要的特征是红细胞表面的H抗原部分或完全缺失，分泌液中存在或不存在H物质。H抗原与ABO血型和Lewis血型密切相关，属于Hh血型系统(ISBT018)[1]。H抗原是在α1,2岩藻糖基转移酶的催化下，将供给底物GDPLfucose上的岩藻糖基转移到接受底物前体糖链上而形成的。α1，2岩藻糖基转移酶的受控基因有2个(FUT1和FUT2)，其中FUT1基因控制H抗原在红系组织表达，而FUT2基因(或Se基因)控制H抗原在分泌液中的表达。现已证实FUT1基因突变是引起类孟买型的主要原因[1-6]。我们对2例类孟买血型进行了分子机理的研究，现将结果报告如下。

　　材料和方法

　　对象

　　2例先证者均为男性，浙江汉族，因无偿献血时发现ABO血型正反定型不符而对他们进行深入研究。

　　方法

　　血清学试剂和方法 单克隆抗A、抗B试剂为上海市血液生物医药有限公司产品，抗H试剂为加拿大Titus 公司产品。 ABO 常规正反定型、 凝集抑制实验检测唾液中血型物质、 Lewis 血型鉴定参见本实验室以前建立的方法[6]。

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)2例类孟买表型的分子机理研究样本DNA提取 以QIAamp Blood Kit 试剂盒(德国Qiagen公司产品)抽提先证者基因组DNA，严格按照试剂说明书进行操作。

　　ABO基因测序 针对ABO血型基因多态性位点最多的第6、7号外显子及部分内含子设计特异性引物，按本实验室以前报道的方法进行ABO基因型分析[7]。

　　FUT1和FUT2基因测序分析 PCR引物参照FUT1和FUT2基因序列，由本实验室采用计算机辅助设计、上海申能博彩公司合成。扩增反应体系总体积100 μl，其中含10×PCR缓冲液10μl，样本DNA 400-500 ng，TaqDNA聚合酶4.0 U(美国Roche公司产品);dNTP和MgCl2终浓度为0.2 mmol/L和2.5 mmol/L(FUT2为2.0 mmol/L)，引物终浓度为0.5 μmol/L。ABI公司的9700型PCR扩增仪扩增，参数为95℃ 预变性5分钟，95 ℃30秒，55℃ 30秒(FUT2为65℃)，72℃ 2分钟，35个循环，72℃延伸10分钟后冷却至4℃。PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳30分钟，紫外透射仪下显示扩增成功后，从凝胶上切取目的DNA片段，用QIAquick Gel Extraction Kit(德国Qiagen公司产品)试剂盒纯化回收DNA片段。将回收纯化的扩增片段按Big Dye Sequencing Kit(ABI公司产品)试剂盒操作进行测序反应，测序引物除PCR扩增引物外，其它测序引物见表1。采用乙醇/醋酸钠法纯化测序PCR产物。纯化产物经热变性速冷上ABI PRISM 377测序仪进行PAGE电泳，采用Sequence Analysis和MT Navigator软件进行数据分析。

　　FUT1基因TOPO TA克隆 严格按试剂(美国Invi trogen公司)说明进行操作，挑取10个阳性克隆，提取质粒，以质粒DNA为模板测序鉴定FUT1基因突变。

　　547-552位两碱基AG缺失的检测

　　采用序列特异性引物PCR和基因扫描方法检测AG缺失，引物见表1，具体实验参照本实验室以前的报道[8]。

　　序列特异性引物PCR(PCRSSP)检测C658T突变 H658T和H658R引物特异性扩增突变等位基因，H658C和H658R引物特异性扩增野生型等位基因。PCR扩增总反应体积为10 μl， 其中含10×PCR缓冲液1.0 μl，样本DNA 50-100 ng，TaqDNA聚合酶0.4 U;dNTP、MgCl2终浓度分别为0.1 mmol/L、1.75 mmol/L，引物终浓度为0.25 μmol/L，设人类生长激素基因为内对照，其引物终浓度为0.15 μmol/L。ABI公司的9700型自动扩增仪扩增，条件为94℃预变性5分钟，94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 30秒，30个循环，72℃延伸10分钟后冷却至4℃。取扩增后标本5 μl，在含0.5 mg/L溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳20分钟，紫外照射仪上观察结果。

　　结 果

　　血型血清学鉴定

　　2例先证者的血型血清学结果见表2。根据血清学反应格局，2例先证者均为罕见的类孟买表型，其中先证者1为Amh表型，先证者2为ABmh表型，其Lewis表型均为Le(a-b+)。

　　ABO基因测序分析

　　先证者1基因型为A101O01(即261G/del杂合);先证者2基因型为A101B101(即261G/G、297A/G、526C/G、657C/T、703G/A、796C/T、803G/C和930G/A)。

　　FUT1和FUT2基因测序分析

　　547-552位的正常对照和658C正常对照见附图A和C。先证者1和先证者2直接测序均发现FUT1基因有两处杂合突变，其中第547-552位两碱基(AG)缺失杂合，第658位C→T杂合。TOPO TA克隆进一步证实一条染色体上FUT1基因547-552位AG两碱基缺失(附图B);另一条染色体上C658T错义突变(附图D)，基因型可定义为h1h3。先证者1和先证者2的FUT2基因均只有常见的357C→T同义突变，并与其分泌状态和Le(a-b+)表型一致[9]。

　　AG缺失突变检测

　　PCRSSP和基因扫描检测到2例先证者均为AG缺失杂合。随机112名样本未检测到本突变位点。

　　C658T突变检测

　　两例先证者在H658T和H658F引物对、H658C和H658F引物对中均有特异性条带，表现为杂合子。随机112名样本仅在H658C和H658F引物对有特异性条带，未检测到本突变点。

　　讨 论

　　红细胞血型系统中存在一些稀有表型，它们在人群中比较罕见，临床上难以找到与其相合的血液，造成输血和配血困难。类孟买型为一种稀有表型，红细胞上表现为部分或全部缺失H抗原。国内已报道的类孟买型个例超过20例，本实验室曾报道过2例类孟买型的分子机理[6]。目前已在欧洲、日本、中国、美国等人群中发现类孟买型[1-6]，该表型个体发育一般无异常，仅表现为红细胞上缺乏H抗原等，而血清中可含有抗H抗体，常出现正反定型不一致。

　　研究表明[10]，类孟买型主要是由于FUT1基因的突变所引起。FUT1基因定位于19号染色体，有4个外显子，而蛋白质编码序列位于第4外显子，糖基转移酶分子由365个氨基酸组成。人体内存在与FUT1高度同源的FUT2基因。FUT1和FUT2基因的产物均为α1，2岩藻糖基转移酶，该酶将岩藻糖连接到糖链前身物质而形成H抗原。FUT1基因控制红细胞膜上H抗原的表达;而FUT2基因控制分泌液中岩藻糖基转移酶的活性，控制分泌液中是否分泌H抗原。目前研究表明，不同人群类孟买型的分子基础不同，从1994年Kell等[10]首次证实类孟买型是由于FUT1基因突变引起，至今已经报道与红细胞上H抗原缺陷有关的突变有近30 种，包括错义、缺失和插入突变等[1-6]，如h1：nt547-552位缺失AG(AGAGAG→AGAG);h2：nt880-882位缺失(TTT→T); h3：nt658C→T; h4:nt35C→T，nt980A→C;h5：nt460T→C;h6：nt522C→A。多数类孟买型为FUT1基因纯合子突变引起，少数是杂合子突变引起。

　　本研究的2例先证者的基因突变均为不同染色体上复合性突变，直接测序为两个杂合性突变，克隆证实两种突变位于不同的染色体上。其中547-552位中AG两碱基缺失，将导致阅读框架发生移码提前形成终止密码，造成氨基酸第184位到267位发生改变，并在氨基酸第268位处合成链被终止。因此突变后合成的氨基酸链长度为267个，只有野生型的73.2%，可能使α1,2岩藻糖基转移酶失去活性，不能合成H抗原。而C658T错义突变将导致第220位精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys)，推测这个氨基酸的取代将可能降低α1,2岩藻糖基转移酶的生物活性。本研究的两例先证者均为h1h3杂合，国内郭忠慧等[11]曾报道过1例h1h1纯合和h3h3纯合类孟买型，而h1h3杂合的类孟买型个体在国内以前尚未见报道。虽然本实验从分子水平证实了这2例类孟买型的基因突变点，但是由于基因突变并不能真正反映下游蛋白质的结构与功能关系，因此实验中发现的两个突变点对H 抗原的表达以及α1，2岩藻糖基转移酶活性的影响仍有待今后进行体外表达研究。

　　【参考文献】

　　1Daniels G. Human blood groups. Oxford:Blackwell Science Ltd，2002： 185-187

　　2Yip SP, Chee KY, Chan PY, et al. Molecular genetic analysis of paraBombay phenotypes in Chinese: a novel nonfunctional FUT1 allele is identified. Vox Sang, 2002; 83:258-262

　　3Kaneko M, Nishihara S, Shinya N, et al. Wide variety of point mutations in the H gene of Bombay and paraBombay individuals that inactivate H enzyme. Blood, 1997; 90: 839-849

　　4Yu LC, Yang YH, Broadberry RE, et al. Heterogeneity of the human H blood group alpha(1,2) fucosyltransferase gene among paraBombay individuals. Vox Sang,1997; 72: 36-40

　　5Wang B,Koda Y,Soejima M, et al. Two missense mutations of H type α(1,2)fucosyltransferase gene (FUT1) responsible for the paraBombay phenotype. Vox Sang,1997; 72:31-35

　　6Yan L, Zhu F, Xu X, et al. Molecular basis for paraBombay phenotypes in Chinese persons, including a novel nonfunctional FUT1 allele. Transfusion， 2005; 45: 725-30

　　7许先国， 何吉，洪小珍等. Ael亚型的分子生物学研究.中国输血杂志，2003;16：74-77

　　8朱发明，许先国，洪小珍等. 一例由α1,2岩藻糖基转移酶基因两碱基缺失引起的类孟买型血型.中华医学遗传学杂志，2004;21：215-218

　　9苏宇清，吴国光，魏天莉等. 中国汉族人FUT2基因突变初步研究.中国输血杂志，2003;16：239-241

　　10Kelly RJ, Ernst LK, Larsen RD, et al. Molecular basis for H blood group deficiency in Bombay (0h) and paraBombay individuals. Proc Natl Acad Sci USA, 1994; 91:5843-5847