血管内皮生长因子反义核酸增强华蟾素诱导K562细胞凋亡

　　作者：陈丽梅,李超民,王怀宇,关键虹　　作者单位：1. 西安交通大学医学院第一附属医院血液科，陕西西安 710061;2. 解放军第451医院心内科，陕西西安 710054

　　【摘要】目的 研究VEGF反义核酸(ASON)增强华蟾素对人慢性粒细胞白血病K562细胞株诱导凋亡效应。方法 合成VEGF ASON转染入K562细胞，4种浓度的华蟾素(1、3、5、7mg/L)作用于K562细胞株24、48、72h，应用Western blot法检测VEGF蛋白的表达，原位细胞凋亡(TUNEL)、流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡。结果 不同剂量华蟾素组对K562细胞株均有抑制作用，并具有时间和浓度依赖性。经VEGF ASON转染的K562细胞株对华蟾素的诱导凋亡作用更加明显。结论 华蟾素在体外一定浓度范围内可诱导K562细胞株凋亡，VEGF ASON可增强华蟾素诱导K562细胞凋亡的作用。

　　【关键词】 华蟾素,VEGF反义核酸,K562细胞;凋亡

　　ABSTRACT: Objective To study the vascular endothelium growth factor (VEGF) antisense oligonucleotide (ASON) Cinobufotalin in enhancing apoptosis induced by human chronic myeloid leukemia K562 cell line. Methods The synthesis of VEGF ASON was transfected into the K562 cells; Cinobufotalin of four concentrations (1, 3, 5 and 7mg/L) acted on the K562 cell line for 24h, 48h and 72h. Western blot was used to detect VEGF protein expression, while in situ apoptosis (TUNEL) and flow cytometry method (FCM method) were employed to detect the apoptosis. Results The different doses of Cinobufotalin all inhibited K562 cell line in time and dosedependent manners. K562 cell line transfected by VEGF ASON had a more pronounced induction of apoptosis. Conclusion The in vitro Cinobufotalin at a certain range of concentration can induce apoptosis in K562 cell line, and VEGF ASON enhances Cinobufotalins effect in inducing apoptosis of K562 cells.

　　KEY WORDS: Cinobufotalin; VEGF antisense oligonucleotide; K562 cell; apoptosis

　　华蟾素是中华大蟾蜍皮水溶性成分制成的注射液，具有清热解毒、消肿止痛之功效。经实验研究及临床试验表明其有一定的抗肿瘤作用，且毒副作用小，使用安全可靠。目前，已应用于肺癌、肝癌、胃癌等的辅助治疗[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor, VEGF)与细胞凋亡的关系已被证实，通过导入VEGF反义核苷酸阻断VEGF的表达能增强化疗药物诱导白血病细胞凋亡的作用[2]。为了进一步了解华蟾素对白血病细胞的作用及VEGF反义核苷酸能否增强其诱导凋亡作用，我们选取人慢性粒细胞白血病K562细胞株进行体外研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人慢性粒细胞白血病细胞株K562由中国医学科学院血液病研究所惠赠。华蟾素购于安徽金蟾生化股份有限公司。RPMI1640培养液为GIBCO公司产品;鼠抗人VEGF mAb、HRP标记的兔抗鼠IgG购自Santa Cruise公司;原位细胞凋亡检测试剂盒(产品编号MK1022)购自华美公司，-20℃冷冻保存，其余试剂均为国产分析纯。

　　1.2 细胞培养

　　K562细胞悬浮培养在含体积分数为100mL/L加热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，培养条件为50mL/L CO2，37℃饱和湿度。3～5d换液1次。取对数生长期细胞，进行实验。

　　1.3 合成VEGF硫代寡核苷酸

　　VEGF硫代寡核苷酸(ASON)的正义链和反义链序列分别为5′CTATCAGCGCAGCTACTGC3′(正义)和5′GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC3′(反义)，分别与VEGF cDNA前3个密码子及其上游部位3个密码子碱基序列互补与一致。随机链由19个碱基随机组合，其碱基成分比例与反义链相同，序列为5′CCTCGTCATGAGACACGTC3′，经基因库检索不与已有的已知编码序列互补。3组寡核苷酸从DNA自动合成仪上由逐步法硫磷修饰合成硫代寡核苷酸，均为上海生物工程公司和上海细胞生物学研究所合成。

　　1.4 脂质体包裹寡核苷酸转染K562细胞

　　3组寡核苷酸脂质体复合物在聚苯乙稀管中配制，脂质体和寡核苷酸的浓度分别为400μmol/L和40μmol/L。直接在培养细胞中分别加正义、反义及随机寡核苷酸脂质体复合物，至终浓度为1.5μmol/L，37℃，50mL/L CO2培养箱中孵育48h。

　　1.5 Westernblotting检测VEGF蛋白

　　裂解经三组寡核苷酸转染的K562细胞，提取细胞溶解液的蛋白质，120mg/L SDS PAGE电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上，用鼠抗人VEGF mAb作Ⅰ抗，HRP标记的兔抗鼠IgG作Ⅱ抗，ECL荧光显色。

　　1.6 MTT法检测华蟾素对K562细胞增殖的影响

　　调细胞浓度至5×107/L，接种于96孔板，每孔200μL，然后分别加入0、1、3、5、7mg/L的华蟾素20μL，每种浓度设6个复孔。将培养板置于含50mL/L CO2及37℃饱和湿度的培养箱内培养。分别于24、48、72h将培养板从培养箱中取出，加入新配制的1g/L MTT 50μL，混匀，在相同条件下继续培养4h后，离心(1000r/min，5min)，弃上清，每孔加DMSO 200μL，震荡10min，使MTT还原产物完全溶解。用酶联免疫检测仪在570nm处测定A值。计算抑制率：抑制率=[(A对照-A实验)/A对照]×100%

　　1.7 原位细胞凋亡的检测

　　根据MTT实验结果选择华蟾素合适的作用浓度和作用时间，将华蟾素作用后的实验组、对照组(分别为经ASON转染和未经ASON转染的K562细胞株)及空白组(无华蟾素作用)细胞涂片用40g/L多聚甲醛PBS液室温固定15min，将涂片置于30mL/L H2O2 30min，以阻断内源性辣根过氧化物酶。涂片浸泡在SSC溶液 80℃ 20min，PBS洗2次，胰蛋白酶消化20min。TdT缓冲液孵育10min，TdT反应液37℃孵育1h。涂片浸泡在SSC溶液10min，以终止反应。过氧化物酶标记链霉亲和素孵育30min，PBS洗2次。DAB显色5～10min，苏木精复染3～5min，常规脱水、透明和封片。

　　1.8 流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡

　　将实验组与对照组悬浮细胞于离心管中制成单细胞悬液，1000r/min，离心5min，弃上清，用PBS缓冲液洗涤1次。将细胞重悬于PBS液中，调整浓度为1×109/L。用400目筛网过滤2次。制备的单细胞悬液用700mL/L乙醇固定，4℃保存过夜，离心弃上清，加200μL RNAase于37℃水浴30min，再加入染色液PI(碘化丙啶600mg/L)500μL混匀，置室温下30min。FAC Calbur流式细胞仪测定荧光强度，激发波长488nm，用Cell Quest 及Modfit软件分析细胞周期，确定细胞周期分布。计算细胞凋亡率：

　　细胞凋亡率=[凋亡细胞数/(凋亡细胞数+未凋亡细胞数)]×100%。

　　1.9 统计学处理

　　数据均以±s表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行方差分析及t检验，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 K562细胞转染VEGF硫代寡核苷酸

　　VEGF正义及随机硫代寡核苷酸转染组K562细胞，经VEGFmAb Western blot法检测，在Mr 4.0×104处显示清晰的蛋白带(图1, lane 2,3)，而VEGF ASON转染组K562细胞VEGF蛋白印记明显减弱(图1, lane 4)。

　　2.2 华蟾素对K562细胞增殖的抑制作用

　　A值反映细胞实际存活数即细胞活力。4种浓度的华蟾素(1、3、5、7mg/L)作用于K562细胞株24、48、72h后的A值见表1。结果表明华蟾素在1～7mg/L浓度范围内能分别明显抑制K562细胞的增殖，并具有时间和浓度依赖性(P<0.01)，7mg/L华蟾素作用72h的K562细胞株A值最低。表1 华蟾素对K562细胞生长的抑制作用(略)

　　2.3 原位细胞凋亡的检测

　　根据MTT实验结果，我们选择7mg/L的华蟾素作用于实验组与对照组K562细胞株72h后，与空白组相比，两组细胞均出现细胞变小、核固缩等凋亡征象，但实验组比对照组细胞凋亡更加明显(图2)。

　　2.4 流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡率

　　7mg/L华蟾素作用于经VEGF ASON转染和未转染的K562细胞株72h后，G1期细胞增加，S期细胞减少，G1/G2比例增大，出现低于G1期DNA含量的亚二倍体凋亡峰(图3)。转染VEGF ASON的K562细胞株与未转染的K562细胞凋亡率分别为(38.6±3.9)%和(16.7±3.7)%，经t检验两者差别有统计学意义(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　联合化疗是目前治疗白血病的常用手段。迄今用于白血病临床的化疗药物包括烷化剂、抗代谢药、植物碱、激素和杂环类等。这些药物的作用是全身性的，毒副作用较强，对起重要防御作用的淋巴细胞、骨髓造血细胞的破坏较大，使机体免疫功能受抑，以至白血病患者死于肺炎、败血症、尿毒症等化疗副作用，且不能消灭微量残留而导致复发。80年代以来，国内外一些研究者以中医理论为基础，结合现代科学技术，从中药中提取了较多的抗白血病制剂，并对中药及天然药物的抗白血病作用进行了实验研究，发现中药及天然药物不仅具有化疗药物杀伤白血病细胞的细胞毒作用，还可以提高机体免疫功能，减轻化疗对机体的损害，并且有逆转耐药作用，同时无明显毒副作用，药源广泛，价格低廉，宜长期服用，是一般化疗药所不能比拟的[3]。因此，利用中药、天然药物及从中提取的有效成分制剂抗白血病，配合化疗和骨髓移植治疗，已经日益受到广泛重视。华蟾素是我国传统生物药材中华大蟾蜍皮经科学方法提取加工制成的水溶性制剂，其重要成分为吲哚生物碱、还原糖、氨基酸以及蟾蜍毒素、蟾蜍色胺等。很多实验研究表明，华蟾素对多种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用，而且对正常组织细胞的毒性很低[34]，这就为研究开发经济、有效的抗癌药物提供了新的线索。

　　白血病细胞恶性增殖的生物学特征与白血病细胞的凋亡减少有关。近年来随着对细胞凋亡研究的深入和发展,人们逐渐认识到诱导细胞凋亡是治疗肿瘤性疾病的一种有效方法和手段。细胞凋亡与细胞周期紧密相关,是由基因调控的细胞的主动死亡过程，在生理刺激或较弱的外界刺激作用下，细胞内部的遗传程序被启动,核酸内切酶被激活,通过一系列复杂的生化过程后出现非随机性DNA降解，其过程与众多凋亡促进和抑制因子有关。近年的研究表明，VEGF除了在实体瘤的生长中起重要作用外，对于血液系统恶性肿瘤的发展也具有重要作用，一方面通过刺激内皮细胞的增生以产生更多的生长因子，另一方面通过自分泌机制促进白血病细胞的生长，抑制凋亡。VEGF是与血管新生相关的特异性生长因子，研究发现恶性血液病细胞亦高表达VEGF蛋白。VEGF及其受体在白血病发生中的作用还不够明确，很可能VEGF有促进癌细胞的存活和生长[5]。通过抑制VEGF的表达而达到诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究众多，VEGF的表达可以通过组织化学方法来判断慢性粒细胞白血病的分期[6]，而将其与抗肿瘤中药制剂联合应用则不多见，并且在加速期亦有一定疗效[78]。

　　本实验结果表明：①华蟾素可以抑制K562细胞的生长，其作用强度与药物浓度及作用时间呈依赖关系，7mg/L华蟾素作用72h的K562细胞株A值最低;②原位细胞凋亡检测确认华蟾素通过细胞凋亡途径诱导K562细胞死亡，转染VEGF ASON的K562细胞较未转染的K562细胞对华蟾素的诱导凋亡作用更加明显;③流式细胞仪检测结果表明华蟾素对细胞周期的影响主要表现为G1/S期的阻滞，影响了肿瘤细胞DNA的复制和蛋白质的合成，使部分肿瘤细胞发生凋亡，转染VEGF ASON的K562细胞较未转染的K562细胞凋亡率显著增加。综上所述，VEGF ASON能显著增强华蟾素对K562细胞的诱导凋亡作用。然而，华蟾素是通过何种途径诱导K562细胞发生凋亡，VEGF反义寡核苷酸又是通过何种途径增强K562细胞对华蟾素的敏感性还有待于进一步研究。

　　【参考文献】

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　　[6]KRAUTH MT, SIMONITSCH I, AICHBERGER KJ, et al. Immunohistochemical detection of VEGF in the bone marrow of patients with chronic myeloid leukemia and correlation with the phase of disease [J]. Am J Clin Pathol, 2004, 121(4):473481.

　　[7]刘斌，何睿，杨小羊，等. 反义血管内皮生长因子原位表达抑制白血病细胞系K562在裸鼠体内生长并诱导其凋亡 [J]. 医学研究杂志, 2006, 35(11):69.

　　[8]沈慧玲，许文林，江云伟，等. 抗VEGF抗体诱导K562细胞凋亡及其机制的研究 [J]. 实用癌症杂志, 2006, 21(2):123125