特发性骨髓纤维化患者JAK2V617F突变研究

　　作者：李伟达,李建勇,张苏江,仇海荣,徐卫　　作者单位：贵阳医学院附属医院血液科，贵阳550004;1南京医科大学第一附属医院血液科，南京 210029

　　【摘要】为了探讨特发性骨髓纤维化(IMF)JAK2V617F点突变发生率及其临床意义，运用等位基因特异性聚合酶链式反应(ASPCR)检测12例IMF患者的JAK2V617F点突变，并探讨JAK2V617F变化与临床、血液学特征的相关性。结果显示：随访期2-15个月，12例患者JAK2V617F点突变检测阳性率为50%，而半数患有血栓史，其血小板数目及骨髓巨核细胞数目相对增多。另6例JAK2V617F点突变阴性患者仅1例有血栓史，血小板数目及骨髓巨核细胞数目相对较低。结论：JAK2V617F点突变阳性IMF患者多数具有典型的临床表现及血液学特点，其血小板数目及骨髓巨核细胞数目相对增多。

　　【关键词】 特发性骨髓纤维化,JAK2V617F点突变,血小板,骨髓巨核细胞

　　Abstract To investigate JAK2V617F mutation and its clinical significance in patients with idiopathic myelofibrosis (IMF), genomic DNA was extracted from peripheral blood cell samples of 12 IMF cases . Allelespecific PCR (ASPCR) was performed to identify JAK2V617F mutation, and the results were confirmed by sequence analysis. A retrospective study was performed to explore the correlation between JAK2V617F mutation and the clinical, hematologic features. The results showed that in followup for 2 to 15 months, the occurrence of the possitive point mutation in 12 patients with IMF was 50%, and the half of these positive patients had thrombosis. Patients with JAK2V617F point mutation had a higher counts of platelets and megakaryocytes in bone marrow than those in patients without JAK2V617F point mutation. Out of other 6 IMF patients without JAK2V617F point mutation only 1 patient had thrombosis, and lower counts of platelets in perepheral blood and megakaryocytes in bone marrow. It is concluded that majority of IMF patients with positive JAK2V617F point mutation have typical clinical and hematologic features, higher incidence of thrombosis, and higher counts of platelets in peripheral blood and megakaryocytes in bone marrow.

　　Key words IMF; JAK2V617F mutation; platelet; megakaryocyte

　　J Exp Hematol 2007; 15(2):387-390

　　特发性骨髓纤维化(idiopathic myelofibrosis, IMF)是由于骨髓造血组织中胶原增生进而影响造血功能的一种骨髓增生性疾病(myeloproliferative disease, MPD)，本病具有不同程度的骨髓纤维组织增生及发生在脾、肝和淋巴结内的髓外造血。我们运用等位基因特异性聚合酶链反应(alleles specific polymerase chain reaction, ASPCR)对12名IMF患者行JAK2V617F突变检测，并结合临床特点进行分析，以期为该病的诊治提供参考。

　　材料和方法

　　样本

　　收集2005年6月-2006年9月来我院就诊的IMF患者12例，男8例，女4例，中位年龄51.5(37-78)岁。患者就诊时症状不一，主要表现为：左上腹痛、腹胀、腹泻;不同程度乏力、头晕、体重下降;少数无明显诱因下肢疼痛，伴乏力，低热;有2例因发热、肺部感染入院;1例无症状，健康体检时发现血常规异常。既往脑血栓1例，下肢静脉血栓2例。诊断符合IMF国内诊断标准[1]。

　　12例患者均行血常规、中性粒细胞碱性磷酸酶、外周血及骨髓细胞形态学、骨髓组织病理活检检测，部分行染色体核型检测，并均有腰椎、骨盆、股骨、胫腓骨的X线平片、CT、MRI影像学检查。

　　ASPCR检测

　　采用患者外周血单个核细胞基因组DNA作为样本，针对JAK2V617F突变位点所在第12外显子共设计3条引物，包括1对外侧引物(forward primer, reverse primer)，扩增片段长度为364 bp;特异性引物(specific primer)跨越G→T突变位点，其C 端倒数第1位碱基错配设计，以扩增具有该突变的标本，扩增片段长度为203 bp。引物序列见表1。采用TouchDown PCR反应程序扩增，JAK2V617F突变检测结果经测序验证。

　　治疗方案

　　根据患者年龄、一般状态及细胞增殖特性选择治疗方案。1例无症状患者未接受治疗，22%患者仅用输血为主的支持治疗。78%患者接受了以下至少1种的治疗方案治疗：雄激素、反应停、美法仑、糖皮质激素、细胞因子、维甲酸和脾切除术。伴有出血、凝血功能异常的患者给予新鲜冰冻血浆及血小板输注，并根据病情给予抗感染等对症治疗，随访2-15个月。

　　统计学处理

　　应用SPSS 13.0软件包处理资料，计量资料用±SD表示，采用t检验。计数资料采用卡方检验。

　　结 果

　　WBC中位数 8 (0.8-15.7)×109 /L，其中WBC<4×109/L 5例，WBC>10×109/L 4例;Hb中位数75 (43-90) g/L;Plt中位数 225.6 (10-769)×109/L。2/3患者外周血涂片均见少数幼稚红细胞，成熟红细胞中可见大小不等的泪滴状细胞;约75%病例可见原粒和早幼粒细胞;10例(83.3%)患者中性粒细胞碱性磷酸酶活性增高;血清尿酸含量增高;9例(75%)患者多次骨髓穿刺表现为干抽, 骨髓活检可见不同程度的纤维化改变。另有3例(25%)患者初诊骨髓活检未见明显纤维化，多次活检见髓腔内造血细胞进行性减少甚或完全消失，呈不均匀的纤维组织增生。对所有患者均行骨髓或外周血的Ph染色体或bcr/abl融合基因检测，结果阴性。4例染色体核型异常，分别为+8和5q-各1例、20q2例。影像学检查未见异常6例，腰椎、骨盆显示局部骨小梁模糊4例，股骨远端致密呈骨硬化2例，其中可见透光区，局部髓腔闭塞。B 超示多数患者有不同程度的脾肿大，伴有肝肿大7例;脾栓塞1例;双肾结石1例。

　　ASPCR检测JAK2V617F突变结果阳性标本电泳显示为203 bp和364 bp两条带，阴性标本仅显示为203 bp条带，正常对照均为阴性(图1)。进一步测序验证阳性标本显示为T峰，阴性标本仅显示为G峰(图2)，正常对照均阴性，JAK2V617F突变

　　Figure 2. Sequence of JAK2V617F point mutation.Wild type is pointed by arrow in the upper image; the mutation type is pointed by arrow in the underside.阳性率为50%。12例IMF患者按照是否具有JAK2V617F突变被分为有突变组和未突变组，携带该突变的患者多数具有典型的临床表现及血液学特点 (表2)， 其血栓发生率增高(50%)，其中下肢静脉血栓2例，脑血栓1例。统计学揭示血栓、肝脾肿大与JAK2V617F突变与否差别无统计学意义(P>0.05)。两组患者的骨髓巨核细胞计数及血小板计数的差别有统计学意义(表3)。12例患者中位随访期9个月，突变组治疗效果欠佳。病程中1例于确诊后3月因骨髓衰竭合并肺部感染死亡;1例确诊后5个月转化为急性髓细胞白血病(M2型)，1例确诊后9个月转化为急性淋巴细胞白血病。

　　讨 论

　　IMF属于MPD中的一种[2]，发病年龄多在50岁以上，男女均可发病，多数起病缓慢，一般自然病程平均5-7年。本组资料除1例确诊时无症状、通过健康体检发现血常规异常、进一步骨髓病理活检确诊外，多数起病缓慢，有较典型临床表现如脾明显肿大或伴肝肿大，静脉血栓(包括脾栓塞1例)，幼稚粒细胞性、幼稚红细胞性贫血，并有较多的泪滴状红细胞以及发热、出汗、体重减轻等全身症状。

　　IMF病因尚不明确，考虑是一种未明原因刺激引起的多能干细胞异常增殖，骨髓纤维组织增生是继发于异常造血细胞增殖的一种反应。近年来国际上多个研究小组报道，MPD患者具有新的分子遗传学异常即JAK2V617F突变[3-7]。研究认为，该点突变是bcr/abl阴性MPD的主要分子致病机制和诊断标志。该突变发生于造血干/祖细胞阶段，携带突变的造血干/祖细胞获得生存优势，而进一步分化发育，且可以通过外周血检测该突变的存在[2-6]。因此，我们采用外周血单个核细胞提取基因组DNA为检测样本，应用ASPCR技术对12例患者的JAK2V617F突变进行了检测，结果经测序鉴定，其阳性率为50%，与国外报道的35%-57%一致[5-8]。JAK2V617F突变所致IMF机制可能与该突变基因所编码的一种胞内酪氨酸蛋白激酶有关。该蛋白通过JAKSTAT途径进行胞内信号的转导，最终促进或调节细胞的增殖，影响骨髓正常造血;携带该突变的细胞还可通过BCLXL、红细胞生成素受体基因(PRV1)[7]、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、白介素3(IL3)等多种细胞因子的信号转导，促进或调节细胞的增殖[9]，但具体机制有待研究。

　　骨髓活检时网状纤维增生是诊断本病的主要依据。本组多数患者初诊时骨髓活检表现出纤维组织增生，但少数初诊时骨髓组织中无纤维化，临床上初诊为难治性贫血、脾大、不明原因的血小板增多，随着病情的进展骨髓的造血功能呈进行性低下，JAK2V617F突变阳性，继而明确诊断。骨髓活检及其组织化学检测可以揭示疾病的进展情况[7]。本研究中除个别病例由于随访时间较短不能得此结论外，多数患者表现上述趋示。染色体检查中可见20q-、+8、5q-等核型，未发现有规律性。但因为IMF患者骨髓干抽难以获得足够标本进行染色体核型分析。

　　按照2001年WHO分期标准把IMF分为纤维化前期(preIMF)和纤维化期(IMFFs)，后者包括伴骨髓硬化症[2]。与以往分期(细胞期、胶原形成期、硬化期)相比，这种分期增加了组织学分期与临床分期(包括预后)的相关性，满足了临床需要。我们根据JAK2V617F突变与否将12例患者分有突变和未突变两组，分析显示JAK2V617F突变与否与2001年WHO分期无明显相关。但JAK2V617F突变阳性患者更易有血栓病史，其中血栓发生率50%，且血小板及骨髓巨核细胞数目相对增多(表2)。而JAK2V617F突变阴性的6例患者中仅1例有血栓史，外周血血小板数大致正常。统计学分析显示，血栓、肝大、脾大等计数数据与JAK2V617F突变与否并无明显相关性，结果有待于增加例数进一步验证。血小板及骨髓巨核细胞数目JAK2V617突变组较未突变组相对增多(P<0.05)(表3)。Kralovics等[5]报道，携带该突变的骨髓增生性疾病患者包括IMF患者，预后较差，具有更高的骨髓纤维化发生率及出血和血栓形成倾向，但机制未明。本组病例较少，随访时间较短，少数确诊时即为急性骨髓纤维化，部分转化为急性白血病，JAK2V617F点突变与IMF患者的血液学特征、治疗及预后的相关性有待于进一步地研究。

　　【参考文献】

　　1张之南, 沈悌. 主编. 血液病诊断及疗效标准. 第2版. 北京:科学出版社.1998: 421-423

　　2Thiele J, Pierre R, Lmbert M, et al. Chronic idiopathic myelofibrosis. Chronic myeloproliferative disease, unclassifiable. In Jaffe ES, Harris NL, Stein H, et al, eds. Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon , France: IARC Press. 2001: 35-38

　　3Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet, 2005;365(9464):1054-1061

　　4James C, Ugo V, Le Couedic JP, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature, 2005;434(7037):1144-1148

　　5Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al. A gainoffunction mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med, 2005;352:1779-1790

　　6Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell, 2005;7:387-397

　　7Zhao R, Xing S, Li Z, et al. Identification of an acquired JAK2 mutation in polycythemia vera. J Biol Chem, 2005;280:22788-22792

　　8Jones AV, Kreil S, Zoi K, et al. Widespread occurrence of the JAK2V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Blood, 2005;106:2162-2168

　　9Rawlings JS, Rosler KM, Harrison DA. The JAK/STAT signaling pathway. J Cell Sci, 2004;117(Pt 8):1281-1283