血小板保养液悬浮汇集血小板在4℃和22℃的贮存效果

　　作者：赵凤绵,张爱红,常缨,陈筱麟,陈红霞　　作者单位：050071 石家庄市，河北省血液中心(赵凤绵、张爱红、常缨、陈筱麟、陈红霞、孙晓红、王毅、张俊兰);河北医科大学第三医院(陈丽平、赵景菊);河北省卫生厅医政处(刘云冬)

　　【关键词】 血小板保养液,悬浮,汇集,贮存;4℃;22℃

　　通常血小板浓缩液(PC)是用血浆作为悬浮介质并在22℃贮存。22℃贮存的PC容易生长细菌限制了PC贮存5 d，而且大量贮存易造成过期报废。这些原因促使人们研究长期贮存PC的方法。笔者对用汇集白膜层方法制备的、用血小板保养液(PASⅢM)和部分血浆悬浮的汇集血小板在22℃和4℃条件下延时贮存至21 d，并对贮存期间不同时段的血小板形态、质量、功能和代谢产物进行了测定，以单采血小板(SDP)作对照。产品在22℃振荡条件下贮存10 d、4℃储血冰箱静置贮存15 d内较好地保持了血小板的特性， 而且4℃贮存的产品不仅能减少细菌污染的风险，还能够延缓血小板的衰老，延长血小板贮存时间。

　　1 材料与方法

　　1.1 血液来源 选择符合《中华人民共和国献血法》健康检查标准的2006年11月至2007年3月的92名随机献血者捐献的新鲜全血，血液单位为400 ml•袋-1•人-1。

　　1.2 仪器与试剂 参照文献[1]。

　　1.3 产品的制备和贮存 用四联袋采集的400 ml/袋新鲜全血，保存在(22.0±2.2)℃，在4～6 h内重离心(3 100 g，13 min)分离出白膜层(BC)(大约30 ml，其中血浆大约15 ml，红细胞(RBC)和BC大约15 ml)，热合后与联袋离断，和血浆进一步过滤、离心和分离;BC在(22.0±2.2)℃条件下静置过夜。将7袋检验合格的、同血型的BC通过无菌导管接合机汇集在一起，并加入200 ml PASⅢM(包括冲洗BC袋子所用)，轻轻混合均匀后离心(755 g，12 min),分离出PASⅢM(2/3)和部分血浆(1/3)悬浮的汇集血小板(PASⅢM汇集BCPC，以下简称产品)，如果产品RBC残留量较多，再次轻离心(145 g，5 min)，分离并通过PF型白细胞(WBC)过滤器过滤去除WBC，将过滤后的产品平分在2个血小板保存袋内，分别在22℃平行震荡仪内振荡贮存和4℃储血冰箱内静置贮存。

　　1.4 血小板计数和红细胞残留量测定 参照文献[4]，同时也测定了反映血小板形态的血小板平均体积(MPV)。

　　1.5 Nageotte计数法测定WBC残余量 参照文献[1]报道的方法。

　　1.6 无菌试验 采用BacT/ALERT 3D系统，对所有的产品在保存的第21天采样，取5 ml样本接种到细菌培养系统中进行需氧菌和厌氧菌培养7 d。

　　1.7 血小板低渗休克反应(HSR)测定 参照文献[1]报道的方法。

　　1.8 产品代谢产物的测定 用血气仪和配套试剂盒测定产品在第1、3、5、7、10、15和21 d的pH值, PO2 (mm Hg)、 PCO2 (mm Hg)、葡萄糖(mmol/L)、乳酸盐(mmol/L)和碳酸氢盐以及钠离子、钾离子、氯离子的含量。

　　1.9 乳酸脱氢酶[LDH(U/L)]的测定 用分光光度计常规方法测定。

　　1.10 血小板聚集功能和活化标志物CD62p阳性率的测定 参照文献[2]报道的方法。

　　1.11 统计学分析 SPSS 11.0 统计软件，计量资料以±s表示，4℃和22℃条件下同一天产品的各种指标的测定结果相比较，以SDP做对照，成组t检验分析所有的变量，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2种贮存条件下的产品第1天的血小板含量、WBC混入量能够达到SDP标准(2.5×1011/袋)和去除WBC的标准(<5.0×106/袋)，尽管2种贮存温度的产品实验均损失大约40 ml，但第21天的血小板计数结果显示22℃产品比4℃产品下降较多(P<0.05)，反映血小板形态的MPV也增加较多(P<0.05)。22℃贮存7 d的产品始终保持旋涡状，而4℃贮存的产品没有观察到旋涡状(数据未显示)。见表1～3。

　　表2 2种贮存温度下PASⅢM汇集BCPC体外功能和HSR的比较(略)

　　注：与4℃比较，*P<0.05;与对照组比较，#P<0.05

　　表3 2种贮存温度下PASⅢM汇集BCPC的代谢情况比较(略)

　　注：与4℃比较，*P<0.05;与对照组比较，#P<0.05

　　3 讨论

　　自西方国家研制出多种PAS以来，延长PC贮存期并使血小板的功能保持良好的设想成为了现实。通常PC在22℃贮藏5 d，大大减少了PC的实用性。本项研究以SDP作对照，观察了用汇集BC方法结合PASⅢM和部分血浆作为悬浮介质制备的产品在4℃和22℃延期保存21 d的效果。PASⅢM中的柠檬酸盐可防止血小板在血浆浓度较低的介质中凝集;醋酸盐在三羧酸循环中的氧化作用提供血小板代谢所需要的ATP，同时能够降低糖酵解速度，醋酸盐还能利用氢离子使PC的pH保持稳定[3]，减少碳酸氢盐的消耗;磷酸盐除作为维持pH的缓冲对外，在糖酵解反应中还具有使3磷酸甘油醛转变成磷酸甘油酯的作用;镁离子通过改变膜流体性或通过形成环腺苷酸(cAMP)抑制血小板在受到刺激时发生聚集[4]，钾离子和镁离子联合应用可减少血小板的活化而使PC在贮存期间的血小板的特性保持的更好，钠离子除维护等渗外还与钠钾离子交换有关。贮存期间的血小板代谢所需要的能量来自血浆中的葡萄糖和醋酸盐氧化释放的ATP;葡萄糖的主要代谢方式是糖酵解，其代谢终产物是乳酸盐和H+离子，H+离子通过缓冲对缓冲维持介质的pH值。醋酸盐的主要代谢方式是三羧酸循环，最终代谢产物CO2能够从保存袋内逸出。表3显示，2种贮存条件的产品和作为对照组的SDP的HSR，在21 d贮存期间逐渐减弱，但2种贮存条件的产品在贮存10 d内HSR恢复率均在可接受范围内(42%～71%)。凝血酶诱导的聚集反应，4℃贮存的产品在21 d贮存期间，与第1天相比无差异(98%～101%)，而22℃贮存的产品(63%～99%)和SDP(48%～88%)与第1天相比显著减小。从表3可见，4℃产品在21 d贮存期间葡萄糖始终都可以被利用，而22℃贮存产品和SDP到第15天时介质中的葡萄糖基本被耗尽。随着葡萄糖含量的减少，乳酸盐水平相应增加。

　　表1 PASⅢM汇集BCPC的质量(略)

　　注：*试验用样本每次取样约5 ml，每袋共计损失约40 ml;与4℃比较，#P<0.05

　　产品在21 d贮存期间 4℃比22℃的糖酵解率减少，乳酸盐的生成量减少，其血小板计数、pH值、PO2、PCO2和碳酸氢盐的浓度保持的很好，LDH的排放量也减少，说明4℃贮存的产品能够延缓血小板的代谢。SDP和2种贮存温度下的产品随着贮存时间的延长均出现PCO2水平下降、PO2水平上升，表明血小板代谢减少和ATP水平减少，通过LDH水平的提高说明凋亡的血小板数在增加。

　　低温能够使圆盘状血小板变成球状，通过MPV升高和旋涡状消失证明血小板从圆盘状变成球状，而球状血小板的许多功能并没有被破坏，本研究对ADP+肾上腺素合用和凝血酶诱导的聚集反应表明，4℃产品的聚集率显著高于22℃产品和SDP的聚集率，文献报道[3-5]相一致。血小板CD62p是血小板活化的重要指标，CD62p存在于血小板α颗粒的内表面，血小板未发生活化时其外表面不表达CD62，一旦血小板受到各种刺激被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，导致CD62在质膜上表达而被检测到，成为活化血小板标志。本研究4℃贮存的产品在7 d内每天的CD62p比22℃的产品高但没有明显差异，10 d后的CD62p，22℃产品明显高于4℃产品，5d后的SDP的CD62p高于2种贮存条件下的产品，表明PASⅢM能够减小血小板活化。由表2和表3可见CD62p与葡萄糖水平、乳酸水平和pH密切相关。尽管人们热衷于把CD62p作为血小板质量的标志，但CD62p的水平不能作为血小板的生存力和输注效果的唯一指标，文献报道输注CD62p阳性的PC后，CD62p可很快游离出血小板膜表面并参与循环而发挥作用[6]。

　　HSR是反映血小板功能的又一重要指标。HSR试验是检测血小板在低渗环境中发生肿胀后，由膜的完整性和能量代谢维持血小板正常体积而恢复其原有形状的能力。每天的HSR之间，SDP明显高于2种贮存条件的产品，22℃产品略高于4℃产品但没有明显差异，所有PC的HSR在21 d贮存期间逐渐减弱。2种贮存条件的产品在10 d内的HSR与文献报道(40%～80%)相一致[1，7]，说明PASⅢM和部分血浆悬浮血小板比较好地保持了血小板膜的完整性和维护血小板正常体积所需要的能量代谢，较好地保持了血小板的功能。

　　总之，本研究从血小板的形态学特征、质量、代谢产物和功能综合分析，得出的结论是：22℃贮存的产品在10d内较好地保持了血小板的特性，但考虑到细菌污染的问题还应限制在5 d内输注完毕;而4℃静置贮存的产品在15 d内很好地保持了PLT的细胞学特征、质量和功能，并且4℃贮存的产品可以和其他4℃贮存的血液成分一样减少了细菌污染的风险。本研究为临床应用提供了一定程度的安全保证和质量依据。据报道4℃贮存血小板被输注后在体内生存时间短[7]，但血小板被清除的机制已弄清，多糖修饰的血小板在4℃贮藏期间能够安全延长血小板在体内循环的存活时间[8]。直接对比糖基化血小板在4℃与22℃贮存的差别是输血医学领域亟待研究的问题，评估血小板减少症患者输注4℃糖基化血小板后的止血效果是对4℃保存血小板的最终研究。

　　【参考文献】

　　1 赵凤绵，孙晓红，张爱红，等.采用HSR方法测定手工汇集浓缩血小板在不同保存温度下的保存效果.中国输血杂志，2008，21：116118.

　　2 赵凤绵，梁晓虎，张爱红. 洗涤混合血小板的质量和部分体外功能的测定. 中国输血杂志，2006，19：375377.

　　3 Italiano JE Jr, Bergmeier W, Tiwari S, et al. Mechanisms and implications of platelet discoid shape. Blood，2003，101:47894796.

　　4 Babic AH, Josefson EC, Kaufman RM, et al. Galactosylation inhibits in vitro phagocytosis of functionally active refrigerated human platelets obtained from standard platelet concentrates. Baltimore: AABB Annual Meeting，2004.

　　5 Choi JW, Pai SH. Influence of storage temperature on the responsiveness of human platelets to agonists. Ann Clin Lab Sci，2003，33:7985.

　　6 Michelson AD. Flow cytometric analysis of platelets. Vox Sang，2000，78:137142.

　　7 Hoffmeister KM, Felbinger TW, Falet H, et al. The clearance mechanism of chilled blood platelets. Cell，2003，112:8797.

　　8 Hoffmeister KM, Josefsson EC, Isaac NA, et al. Glycosylation restores survival of chilled blood platelets. Science，2003，301:15311534.