联合抑制XIAP和MRP逆转HL-60/ADR细胞耐药

　　作者：王晓芳　王椿　秦尤文　颜式可　高彦荣 作者单位：上海市第一人民医院血液科，上海 200080

　　【摘要】 　　本研究探讨HL-60/ADR细胞的耐药机制，比较单独应用MRP、XIAP反义寡核苷酸或二者联合应用对HL-60/ADR细胞耐药的逆转作用。 应用RT-PCR和Western blot分别检测并比较HL-60细胞和HL-60/ADR细胞的BCL-2、XIAP、MDR1、MRP在mRNA和蛋白水平表达的差异。将XIAP和MRP全硫代反义寡核苷酸，以脂质体-反义寡核苷酸复合物的形式单独或联合转染HL-60/ADR细胞，并应用CCK-8实验测定反义寡核苷酸对DNR敏感性影响;用RT-PCR和Western blot检测反义寡核苷酸对XIAP、MRP的mRNA和蛋白表达的影响。结果表明：HL-60/ADR细胞的MRP和XIAP的表达均明显高于HL-60细胞。XIAP和MRP反义寡核苷酸单独应用均能下调XIAP和MRP的表达，增加对柔红霉素的敏感性。二者联合应用与XIAP反义寡核苷酸单独应用比较，并不能增强对XIAP表达的抑制作用(P>0.05)，但使HL-60/ADR细胞对柔红霉素的敏感性明显增加(P<0.05);二者联合应用与MRP反义寡核苷酸单独应用比较，并不能提高HL-60/ADR细胞内DNR浓度及增强对MRP表达的抑制作用，却使HL-60/ADR细胞对柔红霉素的敏感性明显增加(P<0.05)。结论 XIAP和MRP都可能参与了HL-60/ADR细胞的耐药机制，MRP、XIAP反义寡核苷酸的联合应用能更大程度逆转HL-60/ADR细胞的耐药性。

　　【关键词】 白血病,HL-60/ADR细胞,多药耐药,多药耐药相关蛋白;X连锁凋亡抑制蛋白

　　AbstractThis study was purposed to explore the mechanisms of drug resistance of HL-60/ADR cells and to compare the reversal drug-resistante effects of antisense oligonucleotides (AS ODN) of XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) and AS ODNs of MRP (multidrug resistance-associated protein) by use alone or in combination. Reverse transcription- PCR and Western blot were applied to detect the expression of XIAP, BCL-2, MRP and MDR1 in mRNA and protein levels of HL-60 cells and HL-60/ADR cells, respectively. Fully phosphorothioated AS ODN of XIAP and MRP was delivered into HL-60/ADR cells with LipofectamineTM 2000 in the form of liposome-ODN complexes alone or in combination. CCK-8 cell viability assay was used to determine the effect of AS ODN of XIAP and MRP used alone or in combination on the chemotherapy sensitivity of HL-60/ADR cells to daunorubicin (DNR). Reverse transcription-PCR and Western blot were applied to examine the changes of XIAP, MRP in mRNA and protein levels respectively. The results showed that MRP and XIAP were both significantly higher in HL-60/ADR cells than those in HL-60 cells. AS ODN of XIAP and MRP down-regulated the expression of XIAP and MRP in HL-60/ADR cells and increased the sensitivity of HL-60/ADR cells to DNR, respectively. AS ODN of XIAP+MRP did not enhance the inhibition expression of XIAP in HL-60/ADR cells but increased the sensitivity of HL-60/ADR cells to DNR significantly as compared with AS ODN of XIAP (P<0.05). AS ODN of XIAP+MRP did not increase the concentration of DNR nor enhanced the inhibition expression of MRP in HL-60/ADR cells but increased the sensitivity of HL-60/ADR cells to DNR significantly (P<0.05), as compared with AS ODN of MRP. It is concluded that both XIAP and MRP may be involved in the drug resistance mechanisms of HL-60/ADR cells. Drug-resistance of HL-60/ADR cells can be reversed significantly when antisense oligonucleotides of XIAP and MRP were used in combination.

　　Key wordsleukemia; HL-60/ADR cell; multidrug resistance; multidrug resistance-associated protein; X-linked inhibitor of apoptosis protein

　　通过研究传统的体外单细胞耐药模型，证实肿瘤耐药的发生存在多种机制。HL-60/ADR是将HL-60细胞长期暴露于阿霉素(ADR)所得到的多药耐药模型，常被人们用于白血病耐药的研究，其耐药被认为与多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)高表达有关，由于肿瘤细胞的耐药往往具有多因素性，因此HL-60/ADR可能还存在其它的耐药机制。研究发现，X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)在肿瘤耐药细胞系的表达高于亲代细胞系，它在肿瘤细胞的过度表达可能导致肿瘤细胞对多种凋亡刺激产生抵抗，并使其对化疗药物产生耐药。我们研究的目的旨在探讨除MRP高表达外，还要查明HL-60/ADR细胞的耐药是否还与X连锁凋亡抑制蛋白XIAP上调有关，期望通过联合应用针对不同耐药机制的途径更大程度地逆转白血病的耐药。

　　材料和方法

　　细胞培养

　　HL-60细胞为DNR敏感白血病细胞株，由上海血液学研究所提供，培养于含100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素及10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，置37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。HL-60/ADR为阿霉素(ADR)诱导HL-60细胞建立的具有MRP表型的耐药细胞株,由中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所提供，置于含0.5 μg/L阿霉素(ADR)、10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃、5% CO2条件下培养。试验前2周换用无ADR的RPMI 1640培养液培养。

　　反义寡核苷酸和引物合成

　　参照文献[1,2]合成XIAP和MRP的反义寡核苷酸，为了提高反义寡核苷酸的稳定性，对其进行全硫代修饰。为证明反义寡核苷酸作用具有序列特异性，我们分别合成了与XIAP和MRP序列无关的错义序列作为对照。同时合成以FITC标记的XIAP硫代寡核苷酸以测定转染效率。XIAP序列如下：反义序列: 5′ - GCTGAGTCTCCATATTGCC-3′ ，错义序列: 5′ - GGCTCTTTGCCCACTGAAT-3′ 。MRP序列如下：反义序列: 5′ -TGCTGTTCGTGCCCCCGCCG-3′，错义序列: 5′ -CGGCGGGGGCAC GAACAGCA-3′ 。XIAP、BCL-2、MRP、MDR1和β-actin基因引物序列从文献[2-5]中获得并在GenBank中进行核对。上述引物均由上海生工生物技术有限公司合成。

　　HL-60细胞和HL-60/ADR细胞的比较

　　RT-PCR检测取对数生长期细胞，用PBS洗1次，应用TRIzoL试剂(美国Gibco BRL公司)，按产品说明书步骤操作，提取总RNA。取5 μg总RNA，通过Oligo(dT)引物法逆转录合成cDNA。取4μl的cDNA作为模板，进行PCR扩增，以β-actin为内参照。取10 μl的PCR反应产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统扫描条带灰度，以目的基因/β-actin比值表示各组mRNA表达水平。引物序列和PCR工作条件见表1。Table 1. Primer sequences and working condition used in RT-PCR(略)

　　Western blot检测小鼠抗人XIAP单克隆抗体购自R&D公司;小鼠抗人BCL-2(sc-509)、MDR1(sc-13131)、MRP(sc-18835)单克隆抗体和β-actin单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。取对数生长期细胞，用PBS洗1次，提取细胞总蛋白，取蛋白样品加入6×SDS加样缓冲液，于100℃煮沸5分钟变性。加样后于聚丙烯酰胺凝胶电泳(积层胶为5%，分离胶为8%)分离蛋白，积层胶电压为80 V，分离胶电压为120 V，持续约3小时。采用半干转膜仪转膜，条件为130 mA电转移80分钟，将蛋白转至硝酸纤维素膜。10%脱脂奶粉封闭，一抗(1∶200)4℃过夜，二抗(1∶3 000)室温孵育1小时,增强化学发光法(ECL)显色，X光胶片曝光。以β-actin作为内参照，以证明各组蛋白上样量相等。将X光胶片采用Bio-Rad 2000型凝胶成像系统在白光下扫描后，应用Quantity one软件(Bio-Rad公司)进行吸光度分析，以目的基因/β-actin比值表示各组蛋白表达水平。

　　反义寡核苷酸逆转HL-60/ADR细胞耐药的作用

　　实验分组实验分XIAP反义链组(antisense oligonucleotides, AS ODN)、XIAP错义链组(mismatch oligonucleotides, MS ODN)、MRP反义链组、MRP错义链组、XIAP+MRP反义链组、XIAP+MRP错义链组、脂质体组、空白对照组。转染步骤按照LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)说明书进行，寡核苷酸终浓度均为900 nmol/L。

　　转染效率测定FITC标记的XIAP硫代寡核苷酸设4个浓度，分别为：300、600、900、1 200 nmol/L。分别于转染后12、24和48小时取出细胞，用PBS洗2遍，10%(v/v)甲醛/PBS室温固定20分钟，用PBS再次洗涤，滴片，待晾干后，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察，计数100个细胞，计算阳性率。

　　IC50测定转染24小时后，加入DNR(法玛西亚普强有限公司产品)，继续培养72小时，加入CCK-8试剂(株式会社日本同仁化学研究所产品)，每孔10 μl，培养3小时后于450 nm测吸光度(A450)值。抑制率=(1- A450实验组/ A450对照组)×100%。通过药物浓度对数与抑制率之间的线性回归方程计算IC50值。耐药逆转倍数=对照组IC50/实验组IC50。

　　HL-60/ADR细胞内DNR浓度测定转染24小时后，加入柔红霉素(终浓度为0.5 μg/ml)，继续培养1小时，用冷PBS洗3次，立即用流式细胞仪检测HL-60细胞内红色荧光强度，以荧光强度任意单位代表DNR浓度。

　　XIAP、MRP mRNA的RT-PCR检测转染24小时后，收集细胞，提取细胞总RNA，进行RT-PCR。

　　XIAP、MRP蛋白的Western blot检测转染48小时后，收集细胞，提取细胞总蛋白，进行Western blot。

　　统计学处理

　　全部数据采用SPSS 11.5统计软件进行处理，结果数据以X±SD表示，多组间均数比较采用方差分析，两组间均数比较采用t检验，P<0.05为差异具有显著性。

　　结果

　　HL-60细胞和HL-60/ADR细胞的比较

　　MRP和XIAP mRNA表达HL-60/ADR细胞MRP和XIAP条带的亮度均明显强于HL-60细胞(图1)。HL-60/ADR细胞MRP/β-actin和XIAP/β-actin比HL-60细胞分别高156.52%和113.33%，差异具有统计学意义(P<0.05);HL-60/ADR细胞和HL-60细胞的BCL-2和MDR1的条带亮度相近，二者的BCL-2/β-actin和MDR1/β-actin均无统计学差异(P>0.05)。

　　MRP和XIAP的表达

　　与上述RT-PCR结果一致，HL-60/ADR细胞MRP和XIAP条带的亮度均强于HL-60细胞(图2)。HL-60/ADR细胞MRP/β-actin和XIAP/β-actin分别比HL-60细胞高144.13%和154.13%，差异具有统计学意义(P<0.05);HL-60/ADR细胞和HL-60细胞的BCL-2和MDR1的条带亮度相近，二者的BCL-2/β-actin和MDR1/β-actin均无统计学差异(P>0.05)。

　　反义寡核苷酸逆转HL-60/ADR细胞耐药的作用

　　转染效率测定于荧光显微镜下观察，反义寡核苷酸浓度在300-900 nmol/L之间，转染24小时内，随浓度增加及转染时间的延长，具有荧光的HL-60细胞数目增加，且细胞内荧光强度增强，这提示转染效率提高，当浓度为900 nmol/L转染24小时，转染效率最高可达为80%-90%。

　　IC50测定

　　根据药物浓度对数与抑制率之间的线性回归方程计算IC50值。XIAP反义链与MRP反义链单独应用和联合应用均可使HL-60/ADR细胞的IC50明显减小(P<0.05)，分别为0.712 μmol/L，0.810 μmol/L和0.235 μmol/L，且联合应用组的IC50明显地小于单独应用组(P<0.05)(表2)，提示XIAP和MRP都可能参与了HL-60/ADR细胞的耐药机制，联合应用二者的反义寡核苷酸能更大程度逆转HL-60/ADR细胞的耐药，逆转倍数为8.01倍(图3)。Table 2. Effects of AS ODN on the IC50 of HL-60/ADR cellsGroupIC50(略)

　　流式细胞仪检测细胞内DNR浓度XIAP+MRP反义寡核苷酸组HL-60/ADR细胞内DNR浓度与MRP反义寡核苷酸组细胞内DNA含量分别为587±26，546±31，无统计学差异(P>0.05)，但二者细胞内DNA含量明显高于其它组，差异具有统计学意义(P<0.05)(表3)。Table 3. Effect of AS ODN on the intracellular DNR concentration of HL-60/ADR cell (略)

　　反义寡核苷酸对XIAP和MRP mRNA表达影响单独转染XIAP反义链和MRP反义链能够分别下调XIAP和MRP的mRNA(图4)，二者联合转染可同时下调XIAP和MRP的mRNA，但联合转染组和XIAP反义链组的XIAP表达无明显差异(P>0.05);联合转染组和MRP反义链组MRP的表达无明显差异(P>0.05);XIAP+MRP错义链组和脂质体组XIAP和MRP的表达与对照组比较无明显差别(P>0.05)。

　　反义寡核苷酸对XIAP和MRP蛋白表达影响单独转染XIAP反义链和MRP反义链能够分别下调XIAP和MRP的蛋白表达，二者联合转染可同时下调XIAP和MRP的蛋白表达，但联合转染组和XIAP反义链组的XIAP表达无明显差异(P>0.05);联合转染组和MRP反义链组的MRP表达无明显差异(P>0.05);XIAP+MRP错义链组和脂质体组XIAP和MRP的表达与对照组比较无明显差别(P>0.05)(图5)。

　　讨论

　　研究发现，许多肿瘤耐药的共同机制包括所谓的“泵”和“非泵”性耐药，泵性耐药由胞膜蛋白引起，通过将化疗药物由细胞浆或细胞器中泵出，使细胞内药物浓度降低;非泵性耐药主要是与肿瘤细胞抗凋亡防御机制的激活有关。P糖蛋白和MRP是两种主要的ATP结合转运蛋白，与许多肿瘤细胞的泵性耐药有关，过表达ATP结合转运体是多药耐药的主要原因[6,7]。研究发现，大多数耐药的肿瘤细胞都有P糖蛋白和或MRP的过度表达，因此抑制这些蛋白的表达能够降低耐药性，提高疗效，减少细胞毒药物的剂量，减轻对正常组织和器官的毒副作用。近年来，人们多应用针对编码药泵mRNA的反义寡核苷酸来克服或抑制泵性耐药[8-12]。然而，抑制药泵虽然提高了胞内药物浓度，但疗效却无明显提高，其主要原因是肿瘤细胞的抗凋亡防御机制上调，即所谓的非泵性耐药机制的激活[13，14]。研究发现新一代抗BCL-2的mRNA的反义寡核苷酸，能使BCL-2的表达明显受抑，但单独下调BCL-2却并没有引起大量肿瘤细胞发生凋亡，这是由于单独抑制非泵性耐药机制同样不能克服泵性耐药机制，即上述的药泵所致的多药耐药。Pakunlu等[15]的研究发现，联合应用脂质体阿霉素和BCL-2反义寡核苷酸能够诱导敏感的肿瘤细胞发生凋亡，但对表达P糖蛋白的多药耐药的肿瘤细胞几乎无效。 以上事实使我们设想，同时抑制肿瘤细胞的泵性耐药和抗凋亡防御机制可能会大大提高传统化疗药物的疗效，而达到逆转多药耐药的目的。本研究发现，HL-60/ADR除高表达MRP泵蛋白外，还同时有XIAP抗凋亡蛋白的高表达，因此我们设计并评价了联合应用针对MRP的mRNA反义寡核苷酸及针对XIAP的mRNA的反义寡核苷酸对HL-60/ADR的作用，结果发现二者联合应用使HL-60/ADR细胞对柔红霉素的敏感性明显高于二者单独应用。上述结果提示，同时抑制泵蛋白和抗凋亡防御机制的策略能明显提高柔红霉素的抗肿瘤活性，疗效优于单独应用针对MRP的mRNA反义寡核苷酸及针对XIAP的mRNA的反义寡核苷酸。与泵蛋白不同，XIAP的过度表达并不影响化疗药物进入肿瘤细胞并在其中积累，而是抑制肿瘤细胞的凋亡。我们的实验发现，通过下调XIAP的表达，虽然没有提高HL-60/ADR细胞内的药物浓度，但对柔红霉素的敏感性明显增加，提示XIAP与HL-60/ADR细胞的耐药有关。此外,我们发现联合转染XIAP和MRP组与单独转染MRP组比较，二者细胞内的DNR浓度无明显差别，但HL-60/ADR细胞的IC50明显下降，这提示联合转染组疗效增加并不是由于提高了HL-60/ADR细胞内柔红霉素浓度，也进一步证明HL-60/ADR的耐药不仅与MRP高表达有关，XIAP也发挥了重要的作用。因此，我们认为XIAP和MRP都可能参与了HL-60/ADR细胞的耐药机制，联合应用二者的反义寡核苷酸能更大程度逆转HL-60/ADR细胞的耐药。上述研究结果提示,肿瘤耐药往往具有多因素性，明确肿瘤耐药机制并研究联合应用针对不同耐药机制的方案可能有助于克服肿瘤耐药。

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