外源性ＳＨＩＰ基因表达抑制生长因子介导的Ｋ５６２细胞增殖及Ａｋｔ磷酸化

　　作者：杨琳,罗建民,温树鹏　　作者单位：1. 河北医科大学第二医院血液科， 河北 石家庄 050000; 2. 美国印第安纳大学肿瘤研究所， 美国 印第安纳 46202

　　【摘要】【目的】 探讨SHIP基因对IL-3诱导K562细胞系增殖的抑制作用，阐明SHIP对K562细胞作用的机制。【方法】 将慢病毒质粒pReceiver-Lv31-FIV和pReceiver-Lv31-SHIP转染K562细胞;转染细胞与IL-3共培养，Western blot法检测K562细胞Akt磷酸化;观察转染野生型SHIP基因对K562细胞增殖的影响;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺失末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡。【结果】 重组慢病毒载体pReceiver-Lv31-FIV和pReceiver-Lv31-SHIP转染K562细胞，GFP阳性率为74.6%。野生型SHIP基因阻断了IL-3对K562细胞的增殖作用，对照组(K562/FIV)细胞增殖抑制率(3.26%)明显低于转染SHIP基因组细胞增殖抑制率(26.42%，P < 0.05);集落形成实验显示SHIP能显著抑制K562细胞集落形成能力[IL-3作用组K562/SHIP细胞形成集落为60.3 ± 6.6，明显低于IL-3诱导的K562/FIV组(91.7 ± 4.2)](P < 0.01)。细胞形态观察发现凋亡增加，Western blot检测发现转染SHIP基因组前凋亡酶pro-caspase-3降解增加，TUNEL法证实SHIP蛋白促进细胞凋亡。IL-3作用不同时间段(3 h， 6 h， 12 h)，转染野生型SHIP组细胞增殖明显减弱，且Akt磷酸化水平均低于对照组(P < 0.05)。【结论】 SHIP基因负调控生长因子(IL-3)介导的K562细胞增殖及其蛋白激酶活化。

　　【关键词】 基因,肌醇,磷酸酶,慢病毒载体; 细胞增殖; 磷酸化蛋白激酶B; 生长因子

　　Abstract： 【Objective】 To explore the inhibitory effects of SHIP on IL-3 stimulated K562 cell proliferation， and to elucidate the mechanism of SHIP functioning on K562 cells. 【Methods】 pReceiver-Lv31-FIV and pReceiver-Lv31-SHIP plasmids were transfected into K562 cells， and the K562 cells were cultured with IL-3. Phosphorylated Akt of K562 cells was examined by Western blot. The proliferation of K562 cells transfected with SHIP or empty vector were examined. The apoptosis of K562 cells was examined by TUNEL and Western blot. 【Results】 74.6% GFP positive cells were obtained in SHIP group， 3.26% in FIV group (P < 0.05). SHIP protein inhibited the colony formation retroviral vector SHIP-FIV transfected K562 cells. The anti-proliferative rate in K562/FIV (3.26%) was significantly lower than that in K562/SHIP cells (26.42%); the colony formation capacity of K562 decreased after transfected with SHIP (IL-3+K562/SHIP group 60.3 ± 6.6 vs IL-3-K562/FIV group 91.7 ± 4.2， P < 0.05). An increase in the cells with morphologic features of apoptosis was also proved by TUNEL in SHIP-expressing cells. Western blot analysis showed SHIP down-regulated expression of pro-caspase-3. The level of phosphorylated Akt was decreased after stimulated by IL-3 for 1 h， and almost disappeared after stimulated for 24 h. The effect of IL-3 on K562 cell proliferation was inhibited by the transfected wild-type SHIP gene. The phosphorylated Akt in K562 cells were inhibited by the transfected SHIP gene at different time points. 【Conclusion】 SHIP is a negative regulator of IL-3-mediate PKB activation and K562 cell survival.

　　Key words： gene， SIHP; lentiviral vector; cell proliferation; p-Akt; IL-3

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(3)：269-274]SHIP(SH2 domain containing inositol 5′-phosphatase)基因属于肌醇5′磷酸酶家族，仅限于造血细胞特异性表达，在生长因子调节细胞生存的Akt活化中起重要负调控作用[1];急性白血病中PI3K/Akt路径的异常活化在白血病细胞增殖中发挥重要作用。罗建民等[2，3]首次发现急性白血病细胞中存在SHIP基因显性负性突变;我们前期研究[4，5]也表明K562细胞中bcr/abl抑制SHIP基因表达，封闭bcr/abl作用后，SHIP基因表达水平升高，p-Akt水平下调;这些均提示SHIP基因表达缺失可能与白血病发病有关。本研究利用慢病毒载体将SIHP基因导入K562细胞，使其稳定表达SHIP基因，并应用IL-3诱导K562，探讨SHIP基因改变及功能的丢失在抑制生长因子诱导的白血病细胞增殖中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 主要试剂和材料 采用三质粒慢病毒载体系统，载体质粒pReceiver-Lv31含巨细胞病毒(CMV)启动子及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP);包装质粒FIV和VSG由本室前期构建并测序鉴定。小量质粒提取试剂盒购自天根生物公司;细胞培养基DMEM、RPMI 1640购自Gibico公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自HYCLONE公司;胰蛋白酶购自上海生物工程技术服务有限公司;绝对荧光定量PCR试剂盒(针对SHIP)由达安基因公司设计合成(基因序列来自基因库，获取号M77273)。p-Akt(Thr308，Ser473)抗体、Akt抗体、SHIP抗体、pro-caspase3抗体、β-actin抗体购自Santa Cruz公司。Lipofectmine 2000购自美国Introvigen公司。IL-3购自Sigma公司。全自动酶标仪为美国的Bio-Rad Model 550。四唑氮蓝(MTT)为美国Sigma公司产品。

　　1.1.2 培养细胞实验分组 人胚肾细胞系293T包装细胞系购自中国医学科学院血液研究所，用于慢病毒扩增，用含100 mL/L的FBS的高糖DMEM培养基培养。人慢性粒细胞白血病急变细胞系K562为本室长期保存，用含100 mL/L的 FBS的RPMI 1640培养基，加入青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)的培养体系，均在37 ℃， 体积分数5% CO2，饱和湿度环境孵育。实验分3组：转染SHIP基因的K562细胞(K562/SHIP)为实验组，转染空载体K562细胞(K562/FIV)和亲代K562细胞为对照组。每组又分为2个亚组，即各转染组无血清孵育10 h后加IL-3(终浓度为5 ng/mL)(IL-3+K562)或不加IL-3组(IL-3-K562)。

　　1.2 慢病毒包装并检测滴度

　　采用脂质体Lipofectamine2000将3种质粒共转染293T包装细胞，其中载体质粒pReceiver-Lv31-SHIP 10 μg、 FIV 10 μg、 VSG 10 μg， 36 h后荧光显微镜观察GFP表达情况，48 ～ 72 h离心取细胞加入1 × PBS在液氮中反复冻融3 ～ 4次离心取上清，过滤后用无血清DMEM作10-1 ～ 10-6倍稀释，在6孔板中分别接种22 × 106的293T细胞，将1 mL稀释病毒液分别加入到相应的孔中。培养48 h后荧光显微镜下观察各浓度孔GFP表达并计数。

　　1.3 慢病毒感染K562细胞系

　　常规将细胞悬浮于含2 μg/mL PHA、200 mL/L FBS的RPMI 1640培养基中，37 ℃、体积分数5% CO2培养72 h。取6 × 106/mL的处于对数生长期的K562细胞与病毒液按感染指数(MOI)1：3共同培养4 h，加入含200 mL/L 的FBS的RPMI 1640培养液继续培养。48 h后荧光显微镜下观察GFP表达情况，流式细胞仪上机检测表达绿色荧光蛋白的细胞比例计算转染效率。

　　1.4 实时荧光定量PCR检测SHIP在K562细胞表达

　　收集转染的K562细胞，提取细胞总RNA分光光度计测量260 nm的吸光度。取4 μL 加入试剂盒逆转录，取5 μL进行定量扩增。SHIP上游引物： 5′-CGA CAA GAA GCT GAG TCC CTT T-3′，下游引物： 5′-GGT AGT TAA GAT CCC CAA ACC AGA A-3′，探针： 5′-FAM-ACA TCA CTC ACC GCT TCA CGC ACC-TAMRA-3′。参数为93 ℃预变性2 min 1个循环。93 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，共40个循环。GENE5700软件分析结果。实验重复3次。

　　1.5 Western blot检测转染后各组K562细胞内SHIP蛋白和Akt磷酸化水平

　　收集不同转染组各5 × 106个细胞，用蛋白裂解液裂解细胞后，离心去细胞碎片，95 ℃ 10 min后，于100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行蛋白半定量检测。

　　1.6 增殖实验

　　取各组细胞调整密度均为5 × 104/mL，接种于96孔无菌培养板中，每孔200 μL。每个时段下设3个复孔，实验重复3次。以未转染组做为对照，每日取出一板，加入四唑氮兰(MTT)溶液10 μL(10 mg/mL)，孵育4 h后应用平板离心机3 000 r/min(r = 14.7 cm)离心10 min弃上清，再加入200 μL二甲基亚砜(DMSO)终止反应，应用全自动酶标仪测490 nm处吸光度(A)。

　　1.7 集落形成实验

　　K562细胞集落(CFU)计数取上述各组细胞1 × 103个，加入含琼脂(0.03 g/L)及含100 mL/L的FBS的RPMI 1640中，接种于6孔板内，每组3个孔，培养10 d。> 50个细胞的细胞团定为1个集落。

　　1.8 细胞周期分析

　　取1 × 106细胞用700 mL/L冷乙醇(4 ℃)固定30 min，RNase A和碘化丙啶染色60 min (37 ℃)后，进行流式细胞分析。并计算细胞增殖指数(PI)。实验重复3次。

　　1.9 TUNEL法鉴定细胞凋亡

　　按博士德TUNEL试剂盒操作步骤检测，细胞转染5 d后涂片后做TUNEL检测，每张切片随机计数500个细胞。细胞中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。

　　1.10 统计学处理

　　SAS 8.0统计软件分析处理，组间比较采用二因素二水平析因设计方差分析(Factorial ANOVA)。以P < 0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 慢病毒包装、感染及鉴定

　　转染48 h的293T细胞和感染慢病毒48 h的K562细胞，荧光显微镜下均可观察到较强的GFP绿色荧光。将转染48 ～ 72 h后的包装细胞反复冻融3 ～ 4次离心取上清后再感染293T靶细胞48 h后，测定病毒滴度为4 × 107 IU/mL。荧光显微镜下计数感染阳性细胞达(74.6 ± 5.8)%(图1)。感染细胞经FQ-RT-PCR扩增出SHIP mRNA表达明显增强，Western blot方法检测K562细胞中SHIP蛋白也呈阳性表达，而在K562细胞和转染空载体的K562/FIV细胞中，SHIP表达始终很低;上述结果证明慢病毒成功感染K562细胞(图2)。

　　2.2 外源性表现SHIP基因抑制IL-3诱导的K562细胞增殖

　　对各组细胞的生长、形态进行较发现，K562/SHIP组细胞增殖抑制率明显高于K562/FIV组(P < 0.01);各组以相同浓度的IL-3诱导，结果显示IL-3+K562/SHIP组细胞胞增殖抑制率也明显高于IL-3-K562/FIV组(P < 0.01，图3)。

　　2.3 SHIP对K562细胞集落形成的影响

　　培养10 d后，K562/SHIP组细胞形成集落为36.7 ± 7.09，与K562/FIV组(73.3 ± 7.1)相比，对K562细胞集落形成具有明显的抑制作用(P < 0.01);IL-3+K562/SHIP细胞形成集落为60.3 ± 6.62，明显低于IL-3-K562/FIV组(91.7 ± 4.2，P < 0.01)。

　　2.4 SHIP对K562细胞周期的影响

　　流式细胞仪分析结果表明SHIP基因表达使K562细胞G0/G1期细胞比例升高、S期和G2/M期细胞比例降低，PI降低。说明转染SHIP基因能使K562细胞增殖能力降低(表1)。

　　2.5 TUNEL法检测细胞凋亡

　　TUNEL法检测各组细胞凋亡率结果显示K562/SHIP组细胞凋亡率(30.6 ± 9.64%)明显高于K562/FIV组(8.2 ± 2.2%)和K562组(6.6 ± 2.8%)，差异有统计学意义(P < 0.05，图4)。

　　2.6 SHIP对凋亡酶caspase-3表达的影响

　　转染野生型SHIP基因K562细胞可出现pro-caspase-3蛋白表达量有所减少(图5)。

　　2.7 外源SHIP基因抑制IL-3介导的K562细胞Akt活化

　　在静止期细胞，SHIP表达导致Akt磷酸化水平下降;K562/SHIP细胞组Akt磷酸化水平较K562/FIV组下降了3倍，差异有统计学意义(F = 56.18， P < 0.01)。转染后以无血清培养基培养各组细胞10 h后，用IL-3刺激各转染组细胞，检测不同时间点Akt磷酸化水平，发现有外源性SHIP蛋白表达组细胞p-Akt308和p-Akt473水平均增加程度明显低于对照组呈下降趋势，而Akt水平无明显变化;撤除IL-3刺激后，K562/SHIP组细胞Akt磷酸化水平快速下降，而转染空载体组细胞Akt磷酸化水平下降缓慢，持续时间较长;提示SHIP在生长因子诱导的Akt活化过程中起重要的负调控作用(图6)。

　　3 讨 论

　　SHIP基因是继PTEN之后发现的又一个磷酸肌醇酯磷酸酶(PIPase)。该基因位于染色体2q36-37.1，仅限于造血细胞特异性表达，在生长因子介导的造血细胞增殖和生存信号传导途径中起关键负性调控作用，而多种细胞因子的促增殖作用是肿瘤发生发展的重要机制。SHIP的主要功能是特异性清除磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)代谢产物PIP3的5′磷酸基而使其降解为PI(3，4)P2，确保PI3K/Akt信号通路的下调[8-9]。罗建民等[2，3]首次发现在白血病患者存在SHIP基因的功能结构域遗传学突变;在这些突变中，78%的突变集中在SHIP基因的重要结构域，如SH2结构域的FLVRES修饰区、PTPase和PxxP功能区;并且SHIP基因突变的白血病细胞增殖异常，凋亡受抑;随后张苏江等[10]也在急性髓系白血病患者中发现两种新的SHIP突变(A > T，Q1154L Q1153L)。SHIP基因在白血病发病中的作用尚不明了。我们前期研究表明，K562细胞中bcr/abl的表达对SHIP基因功能有抑制作用，封闭bcr/abl能使K562细胞SHIP蛋白重新表达，Akt磷酸化水平下调，这些都表明SHIP基因在白血病发生发展中发挥着重要作用。

　　本研究以SHIP蛋白表达阴性的白血病细胞系K562为研究对象，构建了慢病毒转移质粒，与包装质粒一起构成三质粒慢病毒载体系统，经荧光定量PCR方法和Western blot法证明转染携带野生型SHIP基因慢病毒质粒后K562细胞SHIP重新表达。通过对转染SHIP基因后K562细胞的生物学特性观察，发现K562/SHIP组细胞和IL-3+K562/SHIP组细胞增殖抑制率均明显上升，倍增时间较IL-3诱导及未经IL-3诱导的对照组细胞的倍增时间延长;且克隆形成能力明显下降。细胞周期分析发现，转染SHIP基因组G1期细胞显著增多，G2/M期细胞明显减少，说明DNA合成受到抑制，大多数细胞阻滞于G1期。通过Tunel法检测凋亡发现，转染SHIP组细胞凋亡率明显增加，Western blot检测发现转染SHIP基因导致K562细胞pro-capase-3表达减少，因此SHIP蛋白具有明显的抗增殖和促凋亡作用。

　　PI3K/Akt活化是K562细胞增殖的重要细胞内分子机制，蛋白激酶B(PKB，Akt)处于PI3K/Akt信号转导通路的核心部位，在PI3K的作用下发生2个位点磷酸化，一个是催化结构域Thr308位点，另一个是调节结构域Ser473位点[11];以上位点磷酸化后Akt被激活，促进白血病细胞增殖[12]。本研究对Thr308和Ser473位点Akt磷酸化水平检测结果显示，野生型SHIP基因能显著下调K562细胞Akt308和473磷酸化水平，提示SHIP基因表达缺失是K562细胞基础p-Akt高表达的关键因素之一。

　　为确定SHIP在IL-3诱导K562细胞增殖中是否同样发挥作用，我们将各组细胞在去除血清的培养基中孵育10 h以去除血清的影响，再分别加入相同浓度的IL-3诱导，发现不表达SHIP基因的K562/FIV组和K562细胞与K562/SHIP组细胞相比，Akt磷酸化水平增高更明显，磷酸化时间延长，当从培养基中撤除IL-3作用后，表达SHIP的K562细胞中Akt磷酸化水平迅速下降，而K562/FIV组细胞在撤除IL-3 12 h后仍能检测到p-Akt308和473的较强表达。因此我们认为，SHIP基因在IL-3受体下游的Akt活化中发挥关键负调控作用，SHIP基因可能通过抑制生长因子介导的Akt活化而使白血病细胞凋亡增加，生长受抑。

　　总之，我们的研究证明SHIP基因具有重要的抑制增殖和促凋亡功能，并由此推论SHIP基因缺失在白血病发病机制中可能具有重要作用。SHIP基因突变或表达缺失，削弱了对PI3K/Akt信号传导通路的负调控作用，导致K562细胞中Akt激酶的基础磷酸化水平及细胞因子介导的磷酸化水平均上调;这为研究SHIP基因在白血病中抑癌作用的分子机制奠定了基础。

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